許林平,買 玲,馬 杰,郭永軍#
1)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院科研外事科 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究院 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科 鄭州 450003
乳癌是女性最常見的惡性腫瘤。乳癌死亡人數(shù)居癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的第2位,僅次于肺癌[1]。多胺廣泛表達(dá)于多種組織包括乳癌組織[2]。研究[3-4]顯示多胺可以影響癌癥形成的多種過(guò)程,如轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定、離子門控通道等;抑制多胺的合成與減少細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤形成等密切相關(guān)。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是多胺合成過(guò)程中最重要的限速酶[5]。在包括乳癌在內(nèi)的人類多種上皮源性惡性腫瘤中,多胺水平和ODC活性升高;在動(dòng)物模型中已證實(shí)多胺水平和ODC活性的升高可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,而抑制其活性則可以抑制腫瘤的發(fā)展[6-9]。2000年,在人類ODC基因的調(diào)控區(qū)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)功能性的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP),即G316A,其位于兩個(gè)重要的基因調(diào)控區(qū)(Myc/Max/Mad蛋白結(jié)合區(qū))內(nèi),已證實(shí)這一SNP的改變可通過(guò)影響Myc/Max/Mad蛋白的結(jié)合,進(jìn)而影響ODC的表達(dá)[10]。該研究中作者收集了150例乳癌患者的術(shù)后蠟塊,采用巢式PCR和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè)進(jìn)行ODC G316A的分型,并隨訪收集患者的臨床數(shù)據(jù)和生存時(shí)間,旨在觀察以O(shè)DC G316A進(jìn)行分型后患者生存期是否有差異,為乳癌防治提供新的靶點(diǎn)。
1.1 研究對(duì)象 收集2002年1月至2003年12月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的150例乳癌患者手術(shù)切除組織的蠟塊。以死亡作為終點(diǎn)事件,隨訪截止到2013年8月1日,共有刪失66例。150例患者均為女性,年齡30~72歲,中位年齡48.6歲。腫瘤分期:Ⅰ期45例,Ⅱ期54例,Ⅲ期51例;51例有乳癌家族史。
1.2 DNA提取 利用 QIAamp DNA FFPE Tissue Kits(Qiagen公司),按說(shuō)明書步驟從150例乳癌患者蠟塊中提取DNA。
1.3 引物設(shè)計(jì) 從GenBank上查找ODC G316A基因的序列并應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。
表1 兩對(duì)引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小
1.4 巢式PCR-RFLP檢測(cè) 先應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增出 ODC G316A基因,再利用 RFLP進(jìn)行 ODC G316A 分型。反應(yīng)體系:12.5 μL 2 × PCR Buffer,5 μL 2 mmol/L dNTPs,上、下游引物各 1 μL,0.1 μL KOD,2.4 μL 蒸餾水,1 μL DNA。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95℃進(jìn)行40個(gè)循環(huán),共0.5 min;62℃ 1 min;最后72℃延伸5 min;所有的反應(yīng)均在PerkinElmer 2400 thermocycler(California,USA)上完成。收集PCR產(chǎn)物,加入PstⅠ酶,進(jìn)行毛細(xì)管電泳,應(yīng)用德國(guó)凱杰毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行分析。ODC G316A AG的患者可以得到3個(gè)峰:178、50和120 bp,ODC G316A GG的患者只能得到1個(gè)峰:178 bp,而ODC G316A AA的患者可以得到2個(gè)峰:50和120 bp。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用log-rank檢驗(yàn)比較不同ODC G316A分型患者的生存曲線,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
150例乳癌患者至隨訪結(jié)束有84例患者去世,其中ODC G316A GG患者36例,ODC G316A AA/AG患者48例。150例患者中,ODC G316A AA/AG型72例,ODC G316A GG型78例。中位生存時(shí)間是105.4(79.0 ~126.0)個(gè)月。ODC G316A GG 患者比ODC G316A AA/AG患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間[109.7(86.0 ~ 128.0)個(gè)月 vs 100.6(78.0 ~122.0)個(gè)月;χ2=9.567,P=0.002]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Ⅰ期患者至隨訪結(jié)束無(wú)死亡病例;Ⅱ期患者中,ODC G316A GG與ODC G316A AA/AG患者的中位生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[117.2(88.0~130.0)個(gè)月 vs 111.8(48.0 ~130.0)個(gè)月;χ2=0.012,P=0.914];Ⅲ期患者中,ODC G316A GG 患者比 ODC G316A AA/AG患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間[124.0(68.0 ~124.0)個(gè)月 vs 100.0(46.0 ~100.0)個(gè)月;χ2=5.187,P=0.023]。
ODC基因位于人類第2號(hào)染色體。ODC G316A是位于ODC區(qū)域的一個(gè)功能性SNP位點(diǎn)。有調(diào)查[11]表明,這一多態(tài)性位點(diǎn)在不同種族之間的頻率有較大差異。流行病學(xué)調(diào)查[12]發(fā)現(xiàn),在白種人中ODC AA個(gè)體對(duì)前列腺癌的易感性高于ODC GG個(gè)體,特別是在吸煙者中,ODC AA個(gè)體的易感性較ODC GG 個(gè)體高 5.35倍。之后有研究[13-14]證實(shí)ODC分型對(duì)于結(jié)腸癌患者的預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。
該研究結(jié)果顯示,ODC G316A GG患者比ODC G316A AA/AG患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Ⅱ期患者中ODC G316A GG與ODC G316A AA/AG患者的中位生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Ⅲ期患者中,ODC G316A GG患者比ODC G316A AA/AG患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。提示以O(shè)DC G316A進(jìn)行分型有助于篩選出高危復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者,對(duì)延長(zhǎng)患者生存期和乳癌術(shù)后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及制定相應(yīng)的治療和隨訪方案具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
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