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    ??颂婺釋?duì)ACC-M細(xì)胞凋亡的影響

    2014-10-08 09:06:12楊彩玲張景航任銘新張應(yīng)花崔衛(wèi)剛
    關(guān)鍵詞:???/a>胞質(zhì)孵育

    楊彩玲,張景航,任銘新,張應(yīng)花,崔衛(wèi)剛#

    1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔外科 衛(wèi)輝 453100 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理科 新鄉(xiāng) 453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003

    腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一,具有浸潤性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),預(yù)后較差。??颂婺崾侵袊灾餮邪l(fā)的一種靶向表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)。研究[1-2]發(fā)現(xiàn),EGFR 和活性氧(reactive oxygen species,ROS)參與了小細(xì)胞肺癌等疾病的發(fā)生。ROS產(chǎn)生與清除間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞的生存與凋亡非常重要??寡趸甘乔宄齊OS引起的氧化損傷的主要成員;MnSOD能歧化超氧陰離子形成過氧化氫,清除ROS引起的氧化損傷,是線粒體中重要的抗氧化酶[3-4]。作者觀察了??颂婺釋?duì)ACC-M細(xì)胞凋亡以及MnSOD在線粒體的表達(dá)和對(duì)ROS生成的影響,探討其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 ACC-M細(xì)胞株由上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。ACC-M細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養(yǎng)液中,置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d傳代1次,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。埃克替尼由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司惠贈(zèng),用DMSO溶解,分裝后-20℃保存。DCFH-DA試劑(Molecular Probes公司),Caspase-3活力檢測試劑盒(Sigma公司),MnTMPyP(Calbiochem Merk公司),兔抗MnSOD一抗(Santa Cruz公司),抗兔二抗(KPL公司)。

    1.2 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為6組:對(duì)照組,低、中、高劑量??颂婺峤M(10、20、40 μmol/L ??颂婺崽幚?24 h),MnTMPyP 組(10 μmol/L MnTMPyP 處理 24 h),MnTMPyP+??颂婺峤M(10 μmol/L的MnTMPyP預(yù)孵育1 h,再加入40 μmol/L??颂婺崽幚?4 h)。

    1.3 ACC-M細(xì)胞Caspase-3蛋白活力的檢測 根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行。收集處理后的各組細(xì)胞,在冰上用裂解液孵育30 min,16000 r/min 4℃離心10 min,收集上清液,用底物37℃孵育90 min,Caspase-3活力用分光光度計(jì)在405 nm進(jìn)行測量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:試劑盒提供的4-硝基苯胺用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為 0、10、20、50、100 和 200 μmol/L,作為標(biāo)準(zhǔn)品并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算樣品中Caspase-3蛋白的活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 ACC-M細(xì)胞活性的檢測 向各孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液,37℃孵育4 h,1000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)液,加入相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù),振蕩10 min,測定490 nm波長處的吸光度。細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 ACC-M細(xì)胞ROS水平的檢測 ROS含量用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測。細(xì)胞在含10 mmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基中孵育30 min,經(jīng)埃克替尼和(或)MnTMPyP處理細(xì)胞后,熒光分光光度計(jì)測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平值(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm)。ROS水平=實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 ACC-M細(xì)胞總蛋白、線粒體及胞質(zhì)中Mn-SOD蛋白表達(dá)水平的檢測 細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)蛋白提取參照線粒體提取試劑盒說明書進(jìn)行。收集各組處理后的細(xì)胞,加入預(yù)冷的Mito-cytoBuffer重懸細(xì)胞,1000 r/min離心5 min。取上清,4℃、1000 r/min離心5 min。再取上清,4℃、12000 r/min離心10 min。取上清即為胞質(zhì),提取胞質(zhì)蛋白,用于胞質(zhì)蛋白成分的檢測。線粒體沉淀位于管底,加入0.2 mL Mito-CytoBuffer重懸,12000 r/min離心10 min,棄上清;全細(xì)胞蛋白裂解緩沖液重懸沉淀,測蛋白濃度,保存?zhèn)溆谩2捎肂CA法測定提取蛋白濃度,配置體積分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行蛋白電泳,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜,加入兔抗MnSOD一抗,4℃孵育過夜,TBST清洗 10 min×3次,加入抗兔二抗,室溫孵育2 h,ECL發(fā)光、顯影和定影。β-actin為內(nèi)參。成像分析儀掃描并保存,目的蛋白的表達(dá)水平用目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS的水平及MnSOD蛋白表達(dá)水平的差異,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較 見表1。由表1可見,不同濃度的埃克替尼可以抑制ACC-M細(xì)胞活性,誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞Caspase-3的活力增加,促進(jìn)ACC-M細(xì)胞ROS的生成,而MnTMPyP可拮抗上述變化。

    表1 各組細(xì)胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比較(n=3) %

    2.2 各組細(xì)胞總蛋白、線粒體及胞質(zhì)中MnSOD蛋白的表達(dá)水平 見圖1,表2。??颂婺崽幚硪鹆薓nSOD由線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放。MnTMPyP預(yù)處理ACC-M細(xì)胞1 h能逆轉(zhuǎn)??颂婺嵋鹁€粒體Mn-SOD向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。

    圖1 各組細(xì)胞MnSOD蛋白的表達(dá)

    表2 各組細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)MnSOD蛋白的表達(dá)比較(n=3) %

    3 討論

    細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程。目前認(rèn)為,細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Caspase-3通過抑制DNA修復(fù),啟動(dòng)DNA的降解,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。??颂婺崾且环NEGFR-TKI,可抑制人鱗狀上皮細(xì)胞癌A431細(xì)胞系等腫瘤細(xì)胞的生長和增殖[5-6]。該研究結(jié)果顯示:??颂婺嵩谳^低濃度時(shí)即可抑制ACC-M細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞中Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的活力增加,說明??颂婺崮苷T導(dǎo)ACC-M細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    ROS與腫瘤形成密切相關(guān),是多種藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要信號(hào)分子。研究[7-8]顯示ROS與EGFR-TKI促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn),埃克替尼可促進(jìn)ACC-M細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,與上述研究相符。此外,該研究還發(fā)現(xiàn)利用MnTMPyP預(yù)處理ACC-M細(xì)胞1 h能阻斷??颂婺嵴T導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活力的增加,表明ROS在埃克替尼誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

    MnSOD是線粒體中非常重要的抗氧化因子。MnSOD歧化超氧陰離子形成過氧化氫,使超氧陰離子失去氧化能力。MnSOD蛋白先在胞質(zhì)中翻譯形成然后轉(zhuǎn)位到線粒體;MnSOD蛋白的正確定位對(duì)其發(fā)揮功能非常重要[9]。該研究顯示,MnSOD模擬物MnTMPyP能夠阻斷??颂婺嵴T導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活力的增加,據(jù)此推測,MnSOD可能在??颂婺嵴T導(dǎo)ROS生成過程中發(fā)揮著重要作用。此外,該研究還顯示??颂婺崽幚砗?,MnSOD蛋白在ACC-M細(xì)胞線粒體的表達(dá)減少,在胞質(zhì)中的表達(dá)增加。推測MnSOD從線粒體向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可能參與了??颂婺嵴T導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;MnSOD不能及時(shí)清除線粒體呼吸鏈上產(chǎn)生的氧離子,從而引起細(xì)胞ROS的積累。

    綜上所述,??颂婺嵴T導(dǎo)了Caspase-3蛋白活力增強(qiáng)和ROS的生成,ROS在??颂婺嵴T導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用,該作用可能與MnSOD從線粒體向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位有關(guān)。

    [1]Yamaguchi H,Hsu JL,Chen CT,et al.Caspase-independent cell death is involved in the negative effect of EGF receptor inhibitors on cisplatin in non-small cell lung cancer cells[J].Clin Cancer Res,2013,19(4):845

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    [3]Kroller-Schon S,Steven S,Kossmann S,et al.Molecular mechanisms of the crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase through reactive oxygen species-studies in white blood cells and in animal models[J].Antioxid Redox Signal,2014,20(2):247

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