郭 靜,段 渠,杜艾嬡,鐘振東
1)成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610075 2)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所 成都 610072
蕁麻疹是皮膚科臨床常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病,是由于皮膚、黏膜小血管擴(kuò)張及滲透性增加而出現(xiàn)的一種局限性水腫反應(yīng),主要表現(xiàn)為風(fēng)團(tuán)反復(fù)發(fā)作伴劇烈瘙癢;反復(fù)發(fā)作數(shù)月以上者稱為慢性蕁麻疹[1]。該病發(fā)病涉及多種細(xì)胞和介質(zhì),故病因及病理機(jī)制非常復(fù)雜。慢性蕁麻疹屬中醫(yī)“癮疹”范疇。中醫(yī)認(rèn)為,稟賦不耐,病久體虛,脾肺虛弱,氣血不足,衛(wèi)外失司,風(fēng)邪乘虛而入,其基本病機(jī)屬正虛邪戀之頑癥[2-3]。加味三甲散出自明朝吳又可的《瘟疫論》[2],由鱉甲、龜甲、穿山甲等13味中藥組成,主治瘟疫伏邪已潰,正氣衰微,不能托出表邪,客邪膠固于血脈,主客交渾,肢體時疼,脈數(shù)身熱,脅下錐痛,過期不愈,致成痼疾者。該方主要用于疫癥后期的治療,但根據(jù)該方的整體特性,只要辨證屬于正虛邪戀之重癥頑疾,一般方法用之無效或不佳,即可援引于臨床,如用于對慢性蕁麻疹的治療[4]。作者觀察了加味三甲散對被動皮膚致敏型大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg基因表達(dá)的影響,探究其用于治療慢性蕁麻疹的可能機(jī)制。
1.1 實驗動物 SD大鼠,雌雄各半,體重180~220 g,由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供,實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXKC(111)2008-24。
1.2 藥物、主要試劑與儀器 藥物:加味三甲散提取濃縮液,氯雷他定片(江蘇恒瑞制藥股份有限公司生產(chǎn))。主要試劑:卵白蛋白(Sigma公司),卡介菌疫苗(成都生物制品研究所提供),RNAiso Plus Kit(批號 BK3303)、PrimeScript RT reagent Kit(貨號BK501)及SYBR Premix Ex TaqⅡ Kit(批號BK402)均購自大連寶生物工程有限公司。儀器:電子天平(BS-600L,上海友聲衡器有限公司),RT-PCR擴(kuò)增儀(PIKORed96,美國ThermoFisher儀器有限公司),勻漿機(jī)(DY89-I,寧波新芝生物科技股份有限公司),圖像分析軟件(Motic Images Advanced)。
1.3 實驗動物分組及給藥 60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表分為6組:正常對照組,模型對照組,氯雷他定組(陽性對照組)及加味三甲散高、中、低劑量組,每組10只。給藥前1 d,除正常對照組外,余5組大鼠按文獻(xiàn)[5-6]制作被動皮膚致敏模型。氯雷他定組按10 mL/kg劑量灌胃給予氯雷他定溶液,加味三甲散給藥組分別按38.0、19.0、9.5 g/kg劑量對應(yīng)高、中、低劑量組灌胃給予加味三甲散提取濃縮液,正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積純凈水。各組動物每天灌胃1次,連續(xù)3周。
1.4 外周血單核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg mRNA表達(dá)的檢測 收集各實驗組大鼠血液,4000 r/min離心10 min,棄上清液,收集沉淀,采用一步法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索下載大鼠 β-actin(NM_007393.3)和 CD4+CD25+Treg(NM_001048141.1)基因全序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計篩選各基因特異性引物,見表1。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃退火30 s,40個循環(huán);72℃延伸30 s,得到每個樣品的Ct值。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)量。ΔΔCt= (Ct目的基因- Ct內(nèi)參)實驗組- (Ct目的基因-Ct內(nèi)參)對照組。
表1 基因引物序列及目標(biāo)產(chǎn)物大小
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組大鼠CD4+CD25+Treg mRNA的表達(dá)水平,方差齊者組間進(jìn)行LSD-t檢驗,方差不齊者進(jìn)行Tamhane's T2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
各組大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA表達(dá)的比較見表2。由表2可知,與正常對照組比較,模型對照組大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA的表達(dá)降低;與模型對照組比較,加味三甲散高、中、低劑量組大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA的表達(dá)升高。
表2 各組大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA表達(dá)的比較
嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺和其他炎性介質(zhì)是蕁麻疹發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒的機(jī)制主要有3大類:免疫性、非免疫性和特發(fā)性[7]。自20世紀(jì)80年代起,對調(diào)節(jié)IgE合成的各種因子的研究中,Th1/Th2失衡學(xué)說占據(jù)主導(dǎo)地位。但隨著CD4+CD25+Treg細(xì)胞和FOXP3轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn),對于慢性蕁麻疹的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識。有研究[8]發(fā)現(xiàn)慢性蕁麻疹患者外周血單核細(xì)胞中CD4+細(xì)胞數(shù)明顯高于正常人群,其中CD4+CD25+Treg表達(dá)也明顯高于對照組。這一現(xiàn)象是否是由于CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能上的缺陷導(dǎo)致患者外周血中CD4+CD25+細(xì)胞代償性增殖,以數(shù)量來彌補(bǔ)其功能上的不足,以及中藥能否通過這一途徑達(dá)到治療效果值得關(guān)注。
調(diào)控免疫性發(fā)病機(jī)制是控制蕁麻疹病情的重要環(huán)節(jié)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個重要亞類,其對自身抗原和非己抗原均有較強(qiáng)的免疫抑制作用。Hori等[9]發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞上的一個表面受體OX40可以通過細(xì)胞接觸與依賴FcεRI的肥大細(xì)胞表面的OX40L結(jié)合,促使肥大細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷含量增加,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減少,減少肥大細(xì)胞脫顆粒和過敏反應(yīng),從而減輕蕁麻疹的臨床癥狀。該實驗結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型對照組大鼠外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA的表達(dá)降低;與模型對照組比較,加味三甲散各劑量組外周血單核細(xì)胞CD4+CD25+Treg mRNA的表達(dá)均升高,提示加味三甲散可上調(diào)被動皮膚致敏型大鼠外周血細(xì)胞異常下降的CD4+CD25+Treg mRNA水平,對慢性蕁麻疹患者外周血單核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能的缺陷可能具有一定的干預(yù)作用,與上述研究一致。
[1]趙辨.臨床皮膚病學(xué)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001.
[2]吳又可.瘟疫論[M].北京:中國醫(yī)藥出版社,2011.
[3]莫宗成,王天文,聶飛,等.慢性蕁麻疹的中醫(yī)治療進(jìn)展[J].重慶中草藥研究,2010(1):38
[4]張云平.活血祛風(fēng)湯治療慢性蕁麻疹66例療效觀察[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2005,19(4):243
[5]肖紅麗,眭道順,李東海,等.當(dāng)歸飲子對小白鼠被動皮膚過敏反應(yīng)及血清白三烯B4水平的抑制作用研究[J].四川中醫(yī),2008,26(7):9
[6]李旭波,李娜,侯穎,等.玉屏風(fēng)散加味治療慢性蕁麻疹的作用及機(jī)制[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(5):462
[7]黃小雄,鄒循輝,黃和文,等.慢性蕁麻疹患者單-核細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察IL-4及IFN-γ水平的變化[J].嶺南皮膚性病科雜志,2004,11(2):112
[8]Chen WC,Chiang BL,Liu HE,et al.Defective functions of circulating CD4+CD25+and CD4+CD25-T cells in patients with chronic ordinary urticaria[J].J Dermatol Sci,2008,51(2):121
[9]Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057