二氧化鈰納米顆粒對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用*

呂瑞濤，法憲恩，朱方濤，黃真鋒，高 勇，趙建明

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科 鄭州 450014

缺血性心臟病對(duì)人類健康的危害程度越來(lái)越大。經(jīng)過(guò)溶栓、支架植入、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等方法治療后，缺血心肌組織的血供得以恢復(fù)，但由于心肌缺血再灌注損傷的存在，患者的病情恢復(fù)受到了嚴(yán)重制約。有研究[1]表明，二氧化鈰(CeO2)納米顆?？梢郧宄踝杂苫?，具有抗氧化應(yīng)激的能力。心肌缺血再灌注損傷的主要原因即是氧自由基的大量產(chǎn)生。該研究旨在觀察CeO2納米顆粒對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK－MB)水平的影響，進(jìn)而分析CeO2納米顆粒對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 250～300 g健康成年雄性SD大鼠24只，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;10～25 nm粒徑CeO2納米顆粒，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)554841;SOD、MDA、CAT、LDH、CK－MB 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所;HX－100E型MS4000小動(dòng)物呼吸機(jī)，購(gòu)于成都泰盟科技有限公司;VCX500型超聲細(xì)胞破碎儀，購(gòu)于美國(guó)Sonics公司;DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)于華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將24只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，模型組、假手術(shù)組、CeO2納米顆粒組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行模型的制作。模型組于模型制作前24 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射PBS液(2 mL/kg)，然后成功制作心肌缺血再灌注模型;假手術(shù)組于術(shù)前24 h經(jīng)尾靜脈注射PBS液(2 mL/kg)，左冠狀動(dòng)脈前降支只穿線不結(jié)扎;CeO2納米顆粒組于術(shù)前24 h經(jīng)尾靜脈注射CeO2納米顆粒懸液(2 mL/kg)，模型制作同模型組。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型制作 將大鼠采用腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛的方法麻醉，仰臥位固定并行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。呼吸機(jī)潮氣量設(shè)置為30 mL/kg，70次/min，吸呼比2∶1。于胸骨左緣第4、5肋間心臟搏動(dòng)最明顯處切開皮膚，分離組織進(jìn)入胸腔。撕破心包膜，將心臟充分暴露。在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距離主動(dòng)脈根部約3 mm處穿線，在線結(jié)和心臟表面墊一乳膠管，待大鼠心律規(guī)整后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色先變白而后變紫紺為結(jié)扎成功，結(jié)扎45 min后松解結(jié)扎線，再灌注120 min，缺血心肌組織顏色恢復(fù)為模型制作成功。

1.4 CeO2納米顆粒懸液制備 將CeO2納米顆粒溶于PBS液中，使其充分溶解，制成1000 mg/L的納米懸液。用前在超聲細(xì)胞破碎儀中振蕩2 min，充分混勻，并用0.2 μm針頭濾器過(guò)濾。

1.5 心肌組織病理學(xué)觀察和心肌酶學(xué)檢測(cè) 再灌注120 min后松解結(jié)扎線，處死大鼠并快速取出心臟，取左心室缺血區(qū)心肌組織，使用預(yù)冷生理鹽水沖洗殘留血液，濾紙吸干心肌表面水分，將其分為2份，一份置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化;另一份保存于－80℃冰箱用于SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的檢測(cè)，測(cè)定時(shí)將心肌組織在低溫環(huán)境下研磨成心肌組織勻漿，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間 SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織 SOD、CAT、LDH、CK-MB活性和MDA含量測(cè)定結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，心肌組織中 SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性降低，MDA含量升高;CeO2納米顆粒組與模型組比較，SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性升高，MDA 含量降低。見(jiàn)表 1、2。

表1 CeO2納米顆粒對(duì)心肌抗氧化酶的影響(n=8)

表2 CeO2納米顆粒對(duì)心肌損傷標(biāo)志物和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的影響(n=8)

2.2 心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果 光鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象;模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞腫脹、壞死，排列紊亂，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);CeO2納米顆粒組心肌細(xì)胞腫脹及壞死程度較模型組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色結(jié)果(×200)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷即是缺血心肌在恢復(fù)血液供應(yīng)后，不僅不能完全恢復(fù)組織器官的功能，反而會(huì)出現(xiàn)心肌頓抑、再灌注性心律失常等較再灌注前更加嚴(yán)重的損傷的現(xiàn)象。心肌在正常情況下即能產(chǎn)生一定數(shù)量的氧自由基用于機(jī)體各種代謝需要。心臟針對(duì)氧自由基有其自身的清除機(jī)制，即內(nèi)源性氧自由基清除酶，主要有SOD、CAT、GSH－Px等。內(nèi)源性氧自由基清除酶與體內(nèi)的氧自由基之間保持著動(dòng)態(tài)的平衡。

由冠狀動(dòng)脈的阻塞或者閉鎖引起的心肌缺血，導(dǎo)致一系列復(fù)雜的細(xì)胞事件，引起心肌細(xì)胞的死亡。雖然再灌注后局部缺血組織的血供得到改善，但同時(shí)也會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷[2]。再灌注因?yàn)槟軐?dǎo)致心肌細(xì)胞腫脹、肌原纖維破壞、收縮帶形成和線粒體內(nèi)的鈣磷酸鹽沉積，故而可加速細(xì)胞壞死和對(duì)細(xì)胞膜的損傷。氧自由基對(duì)組織細(xì)胞的損害被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的重要因素之一[3]。當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，氧自由基大量產(chǎn)生，如超氧陰離子、過(guò)氧亞硝酸鹽、羥自由基、一氧化氮、過(guò)氧化氫等，超出了自由基清除酶的清除能力。過(guò)多的氧自由基可以激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞膜的損傷[4]。大量氧自由基與細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成MDA，從而影響細(xì)胞膜的完整性、流動(dòng)性以及通透性。MDA作為氧自由基作用于胞膜不飽和脂肪酸所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可間接反映心肌缺血再灌注損傷的程度[5]。LDH、CKMB主要存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)中，當(dāng)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，胞膜的完整性及通透性發(fā)生改變時(shí)，它們會(huì)從細(xì)胞內(nèi)大量釋放入血液中，故其可作為判斷心肌細(xì)胞受損程度的敏感指標(biāo)[6]。SOD和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用，其活性可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

我國(guó)的稀土儲(chǔ)存量和產(chǎn)量均位于世界首位，稀土納米材料的開發(fā)應(yīng)用擴(kuò)大了稀土的使用范圍。CeO2納米顆粒作為一種稀土材料，被廣泛用于催化、發(fā)光、儲(chǔ)氫、陶瓷等多個(gè)領(lǐng)域[7]。研究[8]表明，CeO2納米顆粒能夠通過(guò)弱化心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激來(lái)改善心肌功能障礙;能夠保護(hù)胃腸皮層細(xì)胞避免放射引發(fā)的傷害，同時(shí)CeO2納米顆粒使組織中的活性氧產(chǎn)生減少，并提高SOD活性[9]。納米顆粒的生物學(xué)效應(yīng)與其表面積大小密切相關(guān)，而隨著納米顆粒的減小，其表面積呈指數(shù)增加趨勢(shì)。納米顆粒的大小與其生物學(xué)效應(yīng)有一定的相關(guān)性[10]。CeO2納米顆粒特殊的空間構(gòu)造使其具有特殊的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)存在的Ce3+和Ce4+在相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程中能夠與組織中的氧自由基結(jié)合，減少氧自由基含量[1]。

在該研究中，模型組心肌組織由于脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA含量顯著升高，LDH、CK－MB活性明顯降低，均表明了再灌注對(duì)心肌細(xì)胞膜的損傷。另外，內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT的活性下降，進(jìn)一步證實(shí)了模型組中氧化應(yīng)激的發(fā)生。光鏡下可見(jiàn)模型組中心肌細(xì)胞腫脹及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象較假手術(shù)組嚴(yán)重，CeO2納米顆粒組較模型組上述現(xiàn)象明顯減輕。

該研究結(jié)果表明，CeO2納米顆粒能減輕大鼠缺血再灌注損傷心肌組織中的氧化應(yīng)激，明顯提高再灌注損傷心肌組織中內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT的活性和LDH、CK－MB的活性，降低MDA的含量，改善心肌細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)，對(duì)心肌細(xì)胞起到較好的保護(hù)作用。但其確切的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用的安全性方面仍然需要進(jìn)行大量深入的研究。

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