人CD137抗體促進NK細胞對乳腺癌細胞特異性殺傷作用的體外研究

劉魯寧 陳雪梅 馬恩奇 田清艷 劉倩倩 劉韜

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一。其中三陰性乳腺癌（trip-negative breast cancer，TNBC）具有侵襲性強、易復發(fā)、進展快、生存期短和預后差等臨床特點[1-2]。乳腺癌的常規(guī)治療手段對TNBC 通常無效[3]。研究顯示，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在大約60%的TNBC患者中高表達[4]。EGFR 激活的信號通路在細胞增殖、分化、黏附、遷移和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，EGFR 的表達情況與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預后和轉移密切相關[5-6]。晚期轉移性乳腺癌患者的自然殺傷（natural killer，NK）細胞對腫瘤細胞的細胞毒功能受到嚴重損害[7-8]。NK細胞對乳腺癌的進展和預后尤為重要，NK細胞的功能受損可導致抗腫瘤免疫逃逸，一定程度上促進了乳腺癌的發(fā)展和轉移[9]。

NK細胞是人體先天免疫的核心組成部分，在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。NK細胞具有主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性殺傷的特點[10]。NK細胞的表型是CD3-CD56+，根據(jù)NK細胞表面CD16 分子的表達情況，可將NK細胞進一步分為CD16neg、CD16dim和CD16brightNK細胞3個亞群[11]。CD16brightNK 可有效地發(fā)揮細胞毒作用，并能產生一定水平的細胞因子，而CD16neg和CD16dimNK細胞可產生高濃度的細胞因子，但是細胞毒性較低[12]。NK細胞對腫瘤細胞的殺傷主要包括以下4種途徑：（1）穿孔素和顆粒酶介導的直接殺傷[13]；（2）膜腫瘤壞死因子家族分子（如FasL、TRIAL）介導的腫瘤細胞凋亡[13]；（3）通過分泌多種細胞因子，如干擾素（interferon，IFN）-γ 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等，協(xié)同抑制或殺傷腫瘤細胞[10]；（4）NK細胞表面表達免疫球蛋白Fc 片段的低親和力受體CD16 分子（FcγR Ⅲ），當它與抗體結合后，會誘導抗體依賴性細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），特異性殺傷與抗體IgG 結合的腫瘤細胞[14]。臨床常用的單抗靶向藥物（赫賽汀、西妥昔單抗、利妥昔單抗等）與NK細胞聯(lián)用，可增強NK細胞的細胞毒性，實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性殺傷[15]。

CD137，又稱4-1BB 或腫瘤壞死因子受體9（TNFR9），在活化的NK細胞和T細胞表面廣泛表達。已知NK細胞中CD137 傳導信號的激活可以促進NK細胞的增殖[16]，提高其抗腫瘤活性[17]，但對其具體作用機制仍知之甚少。本文研究了人CD137抗體是否能增強NK細胞通過ADCC 途徑介導的對EGFR 高表達人乳腺癌細胞系的殺傷作用，同時初步闡明NK細胞的生物學特征和相關作用機制，為EGFR 陽性乳腺癌患者的治療探索一種更有效、更安全的治療方法。

材料與方法

一、材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231（貨號ZQ0118）、MDA-MB-453（貨號ZQ0072）購自上海中喬新舟公司；L15 培養(yǎng)基（貨號11415064）、胎牛血清（貨號16140071）、10 % Blocker BSA（貨號37525）購自美國Thermo公司；人淋巴細胞分離液（貨號LTS1077）購自天津灝洋生物公司；NK細胞無血清培養(yǎng)試劑套裝購自默賽爾生物（貨號MCM002、MCF004）；CD3-FITC（貨號300306）、CD56-PE（貨號318306）、CD16-APC（貨號302012）、CD137- APC流 式 抗 體（貨號309809）、人CD137抗 體（貨號309802）均購自美國Biolegend公司；人EGFR 抗體（兔源，貨號A11351）購自中國Abclonal公司；西妥昔單抗（Cetuximab，愛必妥）購自德國默克公司；Phalloidin-Atto 565（貨號94072）、40%甲醛溶液（貨號47608）購自美國Sigma公司；抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1000）購自美國Vector Laboratories公司；IFN-γ ELISA 檢測試劑盒（貨號430104）購自加拿大STEMCELL公司；TNF-α ELISA 檢測試劑盒（貨號PT518）購自中國碧云天生物公司；DyeLight 800 羊抗兔IgG（貨號042- 07- 15-06）購自美國LI- COR公司；Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG（貨號A0423）、β-actin 抗體（兔源，貨號AF5003）、Tween-20（貨號ST825）、Triton X-100（貨號ST795）、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒（C0016）購自中國碧云天生物公司。

二、方法

1.NK細胞的誘導培養(yǎng)：用人淋巴細胞分離液從健康志愿者來源的肝素鈉抗凝外周血中分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），按照NK細胞處理試劑盒和NK細胞無血清培養(yǎng)基的說明書，培養(yǎng)NK細胞。后續(xù)根據(jù)NK細胞生長狀況用NK細胞無血清培養(yǎng)基進行補液。在培養(yǎng)的第0、8、12、16 天，取樣計數(shù)。培養(yǎng)16 d后，收獲NK細胞，流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞比例。

2.NK細胞表型的檢測：取1×106個誘導培養(yǎng)16 d 的NK細胞，DPBS緩沖液洗1遍后，參照流式抗體使用說明書用CD3-FITC、CD56-PE、CD16-APC 或CD137-APC 進行染色，常溫避光孵育30 min，DPBS 洗1遍后，用0.5 mL DPBS 重懸細胞。流式細胞儀檢測分析NK細胞表型，每個樣本至少分析10 000個細胞。

3.酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測NK細胞分泌細胞因子：取1×106個培養(yǎng)第16 天的NK細胞，用10 μg/mL 人CD137抗體處理4 h后，300×g離心5 min后，吸取上清液，設為CD137抗體處理組，以未加入人CD137抗體的NK細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照。根據(jù)使用說明書，利用ELISA 檢測試劑盒對兩組NK 培養(yǎng)上清中分泌的TNF-α、IFN-γ 濃度進行檢測。

4.乳腺癌細胞EGFR 蛋白表達免疫熒光染色：分別在細胞爬片上接種5 000個乳腺癌細胞MDAMB-231、MDA-MB-453，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，DPBS 洗滌1遍，加入4 %甲醛溶液，室溫孵育20 min；吸棄4 %甲醛溶液，加入DPBS 洗滌2次；加入0.1 % PBST（含0.1 % Triton X-100 的PBS 溶液）室溫處理5 min后，用DPBS 洗滌3次；加入5 % BSA 封閉液，室溫孵育1 h；吸棄封閉液，加入200 μL EGFR 抗體稀釋液，放入4℃冰箱孵育過夜；吸棄一抗溶液，加入0.1 %PBST 溶液洗滌3次；加入200 μL Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG 及Phalloidin-Atto 565 稀釋液，室溫孵育1 h后，用0.1 % PBST 洗滌3次；用封片劑進行封片，避光放置，封片劑干燥后即進行熒光拍攝。

5.Western blot檢測乳腺癌細胞EGFR蛋白表達：將在六孔板中培養(yǎng)的乳腺癌細胞MDA- MB- 231、MDA-MB-453 用含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液進行充分裂解后，14 000×g離心5 min，取上清，利用BCA 法對蛋白濃度進行定量。取含相同質量蛋白質的上清液，加入蛋白上樣緩沖液后95℃以上煮蛋白10 min，使之變性后，- 80℃冰箱保存?zhèn)溆?；用Biofuraw Precast Gel 預制膠進行上樣、跑膠和轉PVDF 膜；使用5 %脫脂牛奶對PVDF 膜進行封閉處理；用5 %脫脂牛奶按照1:1 000 的比例稀釋EGFR 抗體和β-actin 抗體，充分混勻，4℃孵育PVDF 膜1 h；孵育結束后，用PBST 溶液洗膜3次；使用新配制5 %脫脂牛奶以1:10 000 的比例稀釋對應的二抗，充分混勻，常溫避光孵育PVDF 膜1 h；孵育結束后，用PBST 溶液洗膜3次；洗膜完成后，使用Odyssey 雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行拍照。

6.乳酸脫氫酶（LDH）法檢測NK細胞的細胞毒性：根據(jù)殺傷體系中NK細胞、人CD137抗體和西妥昔單抗的添加與否，將乳腺癌細胞殺傷實驗分成8 組（表1）。用LDH 法檢測各組條件下對乳腺癌細胞MDA- MB- 453 和MDA-MB-231 的殺傷比例。大致實驗步驟如下：在96 孔細胞培養(yǎng)板中，按照NK細胞:乳腺癌細胞= 2.5:1 的效靶比設置反應體系，并按照分組加入10 μg/mL 相應抗體，每組設置3個復孔。37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。根據(jù)使用說明書，利用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒分別檢測a～h 組的靶細胞殺傷比例。細胞殺傷比例計算公式：

細胞毒性或死亡率（%）=（實驗組樣品吸光度－樣品對照孔吸光度）/（樣品最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度）×100 %

表1 乳腺癌細胞殺傷實驗分組設計

三、統(tǒng)計學分析方法

采用Graphpad prism 5.0 和SPSS 13.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中CD16 陽性NK細胞比例、NK細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IFN-γ 濃度、乳腺癌細胞殺傷比例結果以x± s表示。兩組NK細胞的細胞表型、細胞因子分泌量比較采用t檢驗；各組乳腺癌細胞殺傷比例的比較采用三因素兩水平的析因分析。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。每組實驗重復3次。

結 果

一、NK細胞的培養(yǎng)結果

顯微鏡下觀察誘導培養(yǎng)至第8、16 天時NK細胞數(shù)量由培養(yǎng)第1 天時的3×106個細胞擴增到1.2×109個細胞，約擴增400倍（圖1～2）。

二、培養(yǎng)第16 天的NK細胞表型檢測結果

誘導培養(yǎng)第16 天時，CD3-CD56+NK細胞比例為85.01 %，其中77.21 %的NK細胞表面表達CD137 分子（圖3）。

三、人CD137抗體促進NK細胞表面CD16 分子的表達結果

與陰性對照組比較，CD137抗體處理組CD16+NK細胞比例（79.57 % ± 0.92 % 比90.43 % ±0.67%）升高，差異有統(tǒng)計學意義（t= 62.029，P=0.010，圖4）。

四、ELISA 技術檢測人CD137抗體促進NK細胞分泌IFN-γ、TNF-α細胞因子的結果

圖1 倒置顯微鏡下觀察誘導培養(yǎng)的NK細胞（a、c 圖×100，b、d 圖×200）

圖2 NK細胞誘導培養(yǎng)16 d 的生長曲線

與陰性對照組比較，CD137抗體處理組NK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ 濃度[（388.90±7.02）pg/mL比（523.90 ± 1.90）pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義（t= 29.339，P= 0.001，圖5a）；CD137抗體處理組NK細胞培養(yǎng)上清中TNF-α 濃度升高[（20.59±4.09）pg/mL 比（47.22±2.14）pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義（t= 8.290，P= 0.014，圖5b）。

五、乳腺癌細胞中EGFR 蛋白表達水平的檢測結果

免疫熒光染色圖結果顯示，MDA-MB-231細胞中高表達EGFR蛋白（綠色通道），而MDA- MB- 453細胞中EGFR 蛋白表達水平相對較低（圖6）。Western blot 結果顯示，MDA-MB-231細胞中高表達EGFR 蛋白，而MDA-MB-453細胞幾乎不表達EGFR 蛋白（圖7）。

六、人CD137抗體增強西妥昔單抗介導的NK細胞對EGFR 高表達乳腺癌細胞的殺傷作用結果

各組乳腺癌細胞的殺傷比例統(tǒng)計值見表2。MDA-MB-453細胞殺傷組的三因素析因分析結果顯示：NK細胞、人CD137 和西妥昔單抗3個因素分別對MDA-MB-453細胞的殺傷都有作用（F=2260.154、42.837、9.846，P均 ＜ 0.05）；NK 細胞和人CD137抗體的一級交互作用有意義（F=25.891，P＜ 0.001），其他一級交互作用（F= 0.319、0.467，P=0.588、0.514）以及三因素的二級交互作用（F= 0.001，P= 0.981）均無意義（表3，圖8）。

圖3 培養(yǎng)第16 天NK細胞的流式檢測

圖4 兩組NK細胞表面CD16表達比例檢測

圖5 NK細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子濃度比較

表2 各組乳腺癌細胞的殺傷比例（± s）

表2 各組乳腺癌細胞的殺傷比例（± s）

分組 實驗重復次數(shù)乳腺癌細胞殺傷比例（%）MDA-MB-453 MDA-MB-231 a 3 3.51±1.07 3.95±1.15 b 3 4.59±1.65 4.51±0.53 c 3 5.72±0.06 5.70±0.27 d 3 6.09±0.24 5.69±0.27 e 3 25.08±1.83 15.34±0.08 f 3 31.24±0.06 22.09±1.86 g 3 26.70±0.83 45.34±0.44 h 3 32.20±0.23 62.71±0.79

圖6 倒置熒光顯微鏡觀察乳腺癌細胞MDA-MB-453 和MDA-MB-231（免疫熒光染色，×400）

圖7 Western blot 檢測乳腺癌細胞中EGFR 蛋白水平

圖8 乳腺癌細胞MDA-MB-453 的殺傷比例統(tǒng)計

MDA-MB-231細胞殺傷組的三因素析因分析結果顯示：NK細胞、人CD137抗體和西妥昔單抗3個因素分別對MDA-MB-231細胞的殺傷都有作用（F值分別為5227.276、201.473、1792.242，P均 ＜ 0.001）。3個因素兩兩之間的交互作用對MDA-MB-231細胞的殺傷也都有作用（F= 183.903、1517.187、33.483，P均 ＜ 0.001）。3個因素的二級交互作用也有統(tǒng)計學意義（F= 41.505，P＜ 0.001）（表3，圖9）。

討 論

NK細胞能非特異性的直接殺傷腫瘤細胞，在機體抗腫瘤和免疫監(jiān)視中具有重要作用[18]。與T淋巴細胞相比，將NK細胞應用于臨床治療腫瘤具有其獨特的優(yōu)勢。首先，NK細胞的殺傷作用不需要抗原致敏，也不受MHC 的限制，可以使用異體來源的NK細胞而不會在體內引起排異反應[19]；其次，NK細胞不會產生細胞因子風暴，臨床應用安全性更高[20]；最后，如果使用具有腫瘤殺傷能力的NK細胞系，則可以按需要提供質量均一性良好的產品，具有開發(fā)成通用型現(xiàn)成細胞藥物的潛能[21]。因此，NK細胞在抗腫瘤免疫細胞治療中受到了越來越多的關注。國內外已開展了多項NK細胞治療血液腫瘤和實體瘤的臨床試驗[22]。目前NK細胞研究主要聚焦于NK細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術[23]、如何促進NK細胞的活化[24]、促進NK細胞對實體瘤的浸潤[25]，以及通過腫瘤特異性抗原基因修飾提高NK細胞對腫瘤的識別和殺傷能力等[26]。最終達到克服體內腫瘤對NK細胞的抑制和免疫逃逸的目的[22]。

表3 乳腺癌細胞殺傷實驗結果的三因素析因分析結果

圖9 乳腺癌細胞MDA-MB-231 的殺傷比例統(tǒng)計圖

本研究針對NK細胞表面的活化信號分子CD137，利用人CD137抗體處理NK細胞，以進一步增強體外擴增培養(yǎng)NK細胞的活化程度，提高其細胞毒性。實驗結果顯示：對體外誘導培養(yǎng)16 d 的NK細胞用10 μg/mL CD137抗體處理4 h后，可促進NK細胞表面CD16 分子的表達，增強NK細胞分泌細胞因子IFN-γ 和TNF-α 的能力。由于CD16分子是介導NK細胞ADCC 殺傷途徑的關鍵分子，本研究還探討了人CD137抗體處理的NK細胞與西妥昔單抗聯(lián)用對乳腺癌細胞的體外殺傷效果。西妥昔單抗是作用于EFGR 的單克隆抗體，臨床上常用于EGFR 陽性腫瘤的靶向治療，能阻止EGFR 與其天然配體結合，打斷腫瘤細胞自泌性無限增殖的惡性循環(huán)，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，增強細胞毒藥物的抗腫瘤作用[27]。西妥昔單抗與NK細胞聯(lián)用時，可充當NK細胞與腫瘤細胞之間的橋梁。西妥昔單抗的抗原結合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）可與腫瘤細胞表面EGFR 蛋白特異性結合，另一端Fc 段可與NK細胞表面的CD16 分子（FcγR Ⅲ）相結合，從而進一步促進NK細胞的活化及對腫瘤細胞的特異性殺傷。本研究選取了EGFR高表達乳腺癌細胞系MDA-MB-231 和EGFR 低表達乳腺癌細胞系MDA-MB-453 作為靶細胞，檢測NK細胞在CD137抗體和（或）西妥昔單抗作用下對靶細胞的殺傷作用，結果顯示：（1）對MDAMB-453細胞，單用NK細胞與NK細胞和西妥昔單抗合用效果無差異，人CD137抗體與西妥昔單抗合用效果與單一用藥均無差異，NK細胞和人CD137抗體合用效果殺傷作用優(yōu)于單一用藥；NK細胞、人CD137抗體以及西妥昔單抗3 者合用與NK細胞和人CD137抗體2 者合用效果無差異。（2）對MDAMB-231細胞，NK細胞、人CD137抗體以及西妥昔單抗任意二者合用，效果均優(yōu)于單一用藥，三者合用則效果最優(yōu)。本研究還存在一定的不足和局限性，具體體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）僅針對乳腺癌細胞系進行了體外研究，還需通過荷瘤動物模型進一步驗證其安全性和體內抗腫瘤效果；（2）僅選取了乳腺癌作為研究對象，還需對其他類型的EGFR 陽性腫瘤進行更廣泛的研究；（3）還需對NK細胞進行更全面的分子機制和功能性分析，以實現(xiàn)對NK細胞的精細化調控，進一步提升NK細胞的功能。

綜上所述，本研究初步證明了人CD137抗體可增強NK細胞分泌細胞毒性因子IFN-γ 和TNF-α 的能力；更重要的是，人CD137抗體還可上調NK細胞表面CD16 分子的表達，從而使得NK細胞可能通過西妥昔單抗介導的ADCC 作用增強對EGFR 高表達乳腺癌細胞的殺傷作用。人CD137抗體、西妥昔單抗與NK細胞的聯(lián)合使用有望為EGFR 陽性乳腺癌患者的治療提供一種更有效的特異性治療措施。作為一種綜合性腫瘤治療措施，要將其廣泛應用于臨床還有很長一段路要走，如臨床試驗的實施方案、不良反應的處理預案、臨床推廣方案的制定等，需要研究機構和醫(yī)院的多方努力。