臍血單個核細胞移植對帕金森病的臨床療效研究

王未飛 于海燕 袁曉玲 趙敏 王敏 蘆倩 王甜 宮殿榮

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的全球第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，其主要病理特征為腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量的缺乏，引起靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)異常和自主神經(jīng)功能紊亂等一系列臨床表現(xiàn)。目前，PD 的發(fā)病機制尚不十分明確，線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)等眾多因素參與了PD 的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物通過腦-腸軸影響神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，與PD 存在密切聯(lián)系[3]。雖然PD 的發(fā)病機制研究有了長足的進步，但目前仍無切實有效的治療手段，無論藥物或手術(shù)，均只能改善癥狀，不能有效地阻止病情的發(fā)展，更無法治愈。

干細胞移植治療PD 是目前的研究熱點，涵蓋了胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞等。人臍血單個核細胞（human umbilical cord blood mononuclear cells，hUCB-MNCs）含有一定量干細胞及豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，有研究發(fā)現(xiàn)其在中風(fēng)和脊髓損傷等動物模型中發(fā)揮很好的治療作用[4-5]，并且本課題組應(yīng)用hUCB-MNCs 治療多系統(tǒng)萎縮患者取得了良好的治療效果，但其對PD 療效尚無相關(guān)報道[6]。本研究采用宮殿榮教授獨創(chuàng)的寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs 治療PD患者，并對患者的臨床及隨訪資料進行總結(jié)分析，以期為臨床治療PD 提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選擇2010年12月至2018年12月聊城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科應(yīng)用寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB- MNCs 治療的31例PD患者。其中男19例，女12例；年齡51～73歲，平均（63.5±7.2）歲；病程5～12年，中位時間為8年；服用左旋多巴等效劑量405～1500 mg/d，平均（629.57±205.33）mg/d。入組標準：（1）符合英國腦庫PD 診斷標準；（2）診斷原發(fā)性PD ≥5年；（3）對左旋多巴藥物有反應(yīng)性，現(xiàn)藥效逐漸減退，或出現(xiàn)藥物治療無效的癥狀波動（開關(guān)現(xiàn)象）和（或）異動癥。排除標準：（1）各種繼發(fā)性帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征以及其他非原發(fā)性PD；（2）既往曾接受PD 手術(shù)治療（包括腦深部電刺激術(shù)和毀損術(shù)）；（3）合并嚴重心腦血管疾病或者消化、呼吸、血液等其他系統(tǒng)重大疾?。唬?）合并有腫瘤或者既往腫瘤病史；（6）合并有其他嚴重神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病無法合作者。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2010067）并得到所有受試者或其家屬的知情同意。

二、方法

1.hUCB-MNCs 制備：無菌條件下采集我院產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻的新鮮臍帶血約150 mL（乙肝五項、丙肝、艾滋病、梅毒等其他相關(guān)傳染性指標均呈陰性），經(jīng)院倫理委員會批準，無倫理學(xué)爭議。由我院中心實驗室專業(yè)人員用臍帶血處理試劑盒（加拿大威爾森公司研制，寧夏中聯(lián)達生物有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：SCR-200I）分離提取hUCB-MNCs，得到hUCB-MNCs 懸液5 mL [（2～3）×108/mL]，檢測細胞活率≥98 %，立即由0℃～4℃低溫運輸箱送達病房，1 h 內(nèi)移植到患者體內(nèi)。

2.hUCB-MNCs 注射：采用寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)[7]注射hUCB-MNCs。具體操作如下：患者去枕平臥，頭置正中，頸伸直，取乳突最高點的下、后各1 cm。常規(guī)消毒鋪洞巾，局部麻醉，穿刺針與外耳道假想連線平行，與頸椎縱軸垂直，沿枕骨下緣進針，穿刺過程中有2次落空感，一旦出現(xiàn)突破感，拔出針芯有腦脊液流出，即進入枕大池，為穿刺成功。留取腦脊液送檢，將已經(jīng)復(fù)溫處理的hUCB-MNCs 5 mL緩慢注入枕大池，拔出穿刺針，按壓穿刺點，無菌敷料覆蓋。操作過程嚴格遵循無菌原則，術(shù)后患者去枕臥位6～8 h。

3.評價方法：統(tǒng)計患者的性別、年齡、病程及左旋多巴等效劑量（levodopa equivalent dose，LED）。LED 的換算公式如下：100 mg 左旋多巴 = 125 mg多巴絲肼 = 100 mg 吡貝地爾 = 100 mg 金剛烷胺 =1 mg 普拉克索 = 5 mg 羅匹尼羅 = 10 mg 司來吉蘭 =133 mg 卡左雙多巴。采用統(tǒng)一帕金森評估量表（unified Parkinson disease rating scale，UPDRS）第Ⅱ部分、第Ⅲ部分、帕金森非運動癥狀評價量表（the non-motor symptoms scale for Parkinson's disease，NMSS）、匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表（Pittsburgh sleep quality index，PSQI），對患者治療前及治療后1、3、6、12個月進行評分，所有評估項目均在藥物“ 開”的條件下進行，即患者服用左旋多巴制劑后藥效達到最佳狀態(tài)下的情況。所有項目的評估均由不參加治療的、有經(jīng)驗的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生獨立完成。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，UPDRSⅡ/Ⅲ、NMSS、PSOI 評分及左旋多巴等效劑量采用Shapiro-Wilk 檢驗，所有變量符合正態(tài)分布以x±s表示，采用重復(fù)測量方差分析對治療前后多個時間點的評分進行比較，各個時間點評分的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs治療對PD患者UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分的影響

由重復(fù)測量方差分析結(jié)果可知，不同時間的UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后3、6、12個月UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表1）。

二、經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs治療對PD患者非運動功能的影響

由重復(fù)測量方差分析結(jié)果可知，不同時間的NMSS 評分及PSOI 評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后1、3、6、12個月NMSS 及PSOI 評分均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表2）。

三、經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs治療對PD患者左旋多巴等效劑量的影響

由重復(fù)測量方差分析結(jié)果可知，不同時間的LED 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后6、12個月LED 下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表2）。

四、治療后不良反應(yīng)

3例患者治療后數(shù)小時開始出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高38℃，未予特殊處理，24 h 內(nèi)體溫逐漸恢復(fù)正常。2例患者治療后出現(xiàn)頭痛，程度輕微，24～48 h 內(nèi)逐漸緩解。其余 患者在術(shù)中及術(shù)后均無特殊不適感。所有患者成功隨訪1年，均未出現(xiàn)出血、感染等穿刺移植相關(guān)并發(fā)癥。

討 論

據(jù)統(tǒng)計，全球現(xiàn)有約580 萬PD患者，而我國患者人數(shù)約為260 萬，居世界第一[8]。老年人群PD 發(fā)病率較高，隨著社會老齡化的加重，我國PD患者將會逐年增多，極大地影響了患者的生活質(zhì)量，給社會帶來沉重的負擔。因此，探索有效的治療方法具有十分重要的意義。

干細胞移植是目前PD 治療研究的熱點，這其中包括神經(jīng)干細胞、胚胎的多巴胺能神經(jīng)元移植，但因倫理學(xué)爭議等一系列問題，限制了其在臨床中的應(yīng)用[9-10]。一項前瞻性研究對7例PD患者側(cè)腦室立體定向注射自體骨髓間充質(zhì)干細胞，術(shù)后隨訪觀察10～36個月，發(fā)現(xiàn)3例患者的UPDRS 評分持續(xù)改善，2例患者的左旋多巴等效劑量明顯減少[11]。但是，骨髓間充質(zhì)干細胞取材相對困難、細胞產(chǎn)率低。因此探索用于治療PD 的其他細胞來源成為重要問題。

表1 寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植臍血單個核細胞治療前后UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分比較（分，± s）

表1 寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植臍血單個核細胞治療前后UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分比較（分，± s）

項目例數(shù) 治療前治療后F 值 P 值1個月 3個月 6個月 12個月UPDRS Ⅱ 31 17.75± 6.81 15.38± 6.14 13.67± 5.62 12.54±4.39 10.41±4.31 4.101 0.013 UPDRS Ⅲ 31 28.53±14.75 26.36±14.03 21.65±10.11 19.37±9.26 16.12±7.44 5.237 0.006

表2 寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植臍血單個核細胞治療前后NMSS、PSOI 評分和LED 比較（± s）

表2 寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植臍血單個核細胞治療前后NMSS、PSOI 評分和LED 比較（± s）

項目例數(shù) 治療前治療后F 值 P 值1個月 3個月 6個月 12個月NMSS（分）31 58.94±35.74 50.27± 31.06 41.38± 28.25 38.42± 25.73 36.15± 24.56 6.375 0.000 PSOI（分）31 11.68± 5.27 6.53± 4.92 3.68± 2.45 2.87± 1.63 2.14± 1.02 7.428 0.000 LED（mg/d）31 629.57±205.33 593.35±194.82 551.36±190.14 435.54±160.62 300.71±135.83 4.061 0.015

hUCB-MNCs 來源豐富，免疫原性低，可以直接用于異體移植，對供者沒有傷害[12]。hUCB-MNCs含有一定量的干細胞及豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子[13-14]，這使得其成為一種可以治療神經(jīng)退行性疾病很有潛力的細胞。有研究表明，與hUCB-MNCs 有相似來源的臍帶間充質(zhì)干細胞移植后可改善PD 模型鼠的行為學(xué)障礙，而且能夠減少腦內(nèi)神經(jīng)元的損傷[15]。Karlupia 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，相較于臍帶間充質(zhì)干細胞，hUCB-MNCs 治療更有利于缺血性腦卒中神經(jīng)缺損功能恢復(fù)。由此，筆者團隊對hUCB-MNCs 移植對PD 的治療效果進行了深入探索。

本研究的另一項優(yōu)勢在于細胞治療途徑。目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療途徑主要有靜脈輸注、側(cè)腦室穿刺、腰椎穿刺和立體定向移植等，但均存在不同缺點。宮殿榮教授國際首創(chuàng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)（宮氏穿刺法），并將其作為hUCB-MNCs 移植的獨特途徑，目前已成功完成1 000 余人次穿刺，證明了其有效性和安全性[7]。理論上，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)將細胞導(dǎo)入枕大池，在內(nèi)源性遷移途徑的引導(dǎo)下到達目標區(qū)域，避免直接植入損傷區(qū)炎性環(huán)境影響移植細胞的存活[17]，亦避免了細胞經(jīng)靜脈治療途徑中的肺部清除及腰椎穿刺注入的細胞在各神經(jīng)根處丟失[18]。枕大池與第四腦室直接相通，寰枕間隙側(cè)方穿刺治療既可以達到側(cè)腦室穿刺治療同等效果，又能減少手術(shù)創(chuàng)傷和并發(fā)癥[19]。

應(yīng)用便捷易獲得的hUCB-MNCs，結(jié)合獨特的細胞移植途徑，針對PD 取得了良好的治療效果。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB- MNCs 治療后3個月，PD患者的運動功能評分改善，提高了患者的日常生活能力，于治療后6個月左旋多巴等效劑量明顯減少。PD 除表現(xiàn)為運動障礙外，同時可伴有心血管系統(tǒng)障礙、泌尿系障礙、性功能障礙、情緒與認知障礙等非運動癥狀，睡眠障礙在PD患者中亦很常見，文獻報道PD患者睡眠障礙的發(fā)生率為75 %～98 %[20]，這些非運動癥狀因為嚴重影響患者生活質(zhì)量而受到研究者越來越多的關(guān)注。目前的藥物及手術(shù)治療均致力于改善患者的運動障礙，對非運動癥狀收效甚微。然而，本研究發(fā)現(xiàn)PD患者經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB- MNCs治療后1個月NMSS 及PSOI 評分均較治療前顯著下降，并在12個月的隨訪期間進行性改善，這提示經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs 治療對于PD患者非運動癥狀起效較快，并且療效顯著持久。目前其治療機制尚不明確，推測其通過激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞、改善腦內(nèi)微環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫機制和促進多種神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌等機制發(fā)揮治療作用[21-22]。

綜上所述，對于PD患者，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNCs 治療是一種有效的方法，尤其對于非運動癥狀起效快而顯著。本研究納入病例數(shù)較少，存在一定局限性，尚需擴大樣本量，進行多中心的隨機對照研究以進一步驗證其療效。