多配體蛋白聚糖-4脫落在瓣膜性心房顫動患者左心房炎癥反應(yīng)中的作用

原暉華，吳 韓，李 苒，謝 峻，李冠男，陳琴花，徐 標

0 引 言

房顫是老年人最常見的心律失常，房顫的發(fā)病率會隨著年齡的增大而增加，并可導致嚴重的心功能不全及血栓形成，特別是左心房內(nèi)栓子脫落引起腦梗死［1］。房顫的發(fā)生發(fā)展與炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，局部炎癥可致心房結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，為房顫的發(fā)生奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但房顫時加速局部組織炎癥反應(yīng)的因素尚不清楚［2－5］。多配體蛋白聚糖-4(Syndecan-4)是硫酸乙酰肝素類的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白多糖Syndecan家族的成員之一，在傷口愈合、炎癥、血管新生等方面起重要調(diào)節(jié)作用［6］。研究表明病理條件下Syndecan-4胞外段可從細胞膜上脫落，參與肺臟和心臟炎癥反應(yīng)過程的調(diào)控［7］。本研究觀察Syndecan-4脫落在瓣膜性房顫患者左心房炎癥反應(yīng)中的作用，以期發(fā)現(xiàn)房顫時心房局部炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年10月至2013年10月在我院心胸外科住院的60名擬擇期行瓣膜置換術(shù)或瓣膜成形術(shù)的瓣膜病患者，病變部位包括二尖瓣、主動脈瓣病變或雙瓣膜病變。分為竇性心律(sinus rhythm group，SR)組、陣發(fā)性房顫(paroxysmal atrial fibrillation group，PaAF)組和持續(xù)性房顫(persisitent atrial fibrillation group，PeAF)組，每組各20例。對照組選取先天性心臟病但無瓣膜病變及房顫的患者10例。排除標準:①家族性陣發(fā)性房顫患者;②有影響房顫發(fā)生的疾病史(如甲狀腺功能亢進癥)患者;③肺動脈疾病、心肌病、腎臟疾病患者;④二次開胸手術(shù)患者。記錄患者基本臨床資料，并于術(shù)前常規(guī)行二維心臟彩超檢查。房顫分類參考2010年歐洲心臟病學會房顫管理指南定義。本研究嚴格遵循1975年《赫爾辛基宣言》(1983年修訂)所規(guī)定的操作規(guī)程，并且得到了南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司，Syndecan-4抗體購自美國BioSciences公司，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和高遷移率族蛋白 B1(high mobility group protein B1，HMGB1)抗體購自美國Bioword公司，β肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruze公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記二抗為美國Santa Cruze公司產(chǎn)品，超敏化學發(fā)光試劑盒由美國GE公司提供。HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。小型垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)化儀、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和凝膠圖像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 心臟左心房組織標本的采集和儲存 手術(shù)開胸后，在心臟體外循環(huán)建立之前采集少量左心房組織樣本。小部分用4%甲醛固定做組織病理HE染色，其余部分則迅速放入液氮中，隨即轉(zhuǎn)至－80℃冰箱中保存待測。

1.3.2 左心房組織 iNOS、HMGB1和 Syndecan-4 蛋白表達水平檢測 采用Western blot檢測:取左心房組織，磷酸緩沖液洗滌，剪碎后加入RIPA裂解液冰上裂解，勻漿，4℃條件下12000×g離心10 min，取上清使用BCA法測定蛋白濃度后置入100℃水浴5 min，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶室溫封閉1 h，向PVDF膜滴加抗Syndecan-4抗體(稀釋度為1∶500)、抗HMGB1抗體(稀釋度為1∶1000)、抗 iNOS 抗體(稀釋度為 1∶1000)，以β-actin抗體作內(nèi)參(稀釋度為1∶2000)。用TBST緩沖液4次洗膜后加入連接有HRP的二抗，然后重復洗膜，加入發(fā)光劑顯色。條帶使用BioRad Quantity One imaging軟件定量分析。

1.3.3 左心房組織HE染色 4%甲醛固定的組織標本石蠟包埋，并切成4 μm厚的切片。切片用二甲苯脫蠟，然后依次浸泡在含乙醇100%～75%濃度遞降的溶液中，然后常規(guī)行HE染色。每張HE染色的石蠟切片觀察5個不同視野。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用平均值±標準差()表示，計數(shù)資料用百分率表示。多個獨立樣本率(構(gòu)成比)的比較使用χ2檢驗，多組獨立定量資料使用方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni法。雙變量正態(tài)分布資料的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，等級資料相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線臨床特征 3組瓣膜病患者年齡、體重指數(shù)、心衰狀態(tài)、射血分數(shù)(ejection fraction，EF)值及術(shù)前用藥無明顯差異。與SR組相比，PaAF組和PeAF組左心房內(nèi)徑明顯增大(分別為P=0.006和P＜0.001)，且PeAF組左心房內(nèi)徑明顯大于PaAF組(P ＜0.001)。見表1。

表1 60例瓣膜病患者的基線資料比較()Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients studied()

表1 60例瓣膜病患者的基線資料比較()Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients studied()

NYHA分級:紐約心臟病學會(NYHA)心功能分級;與SR組比較，*P＜0.05;與PaAF組比較，#P＜0.05

參數(shù) SR組(n=20) PaAF組(n=20) PeAF組(n=20) F值或χ2值 P值9/11 12/8 11/9 0.938 0.626年齡(年) 52.5 ±7.0 52.4 ±8.3 53.6 ±8.6 1.112 0.336體重指數(shù)(kg/m2) 22.3 ±3.1 22.7 ±2.4 23.1 ±2.7 0.170 0.844 NYHA 分級Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ(n) 4/6/8/2 3/6/9/2 4/7/7/2 0.542 0.997超聲心動圖參數(shù)左心室舒張末期內(nèi)徑(mm) 51.9 ±6.3 53.4 ±6.1 55.3 ±8.4 0.509 0.604左心室收縮末期內(nèi)徑(mm) 40.2 ±4.4 43.8 ±8.1 44.4 ±6.9 0.744 0.480左心室射血分數(shù)(%) 52.8 ±4.2 50.1 ±4.4 49.7 ±3.9 0.744 0.480左心房內(nèi)徑(mm) 41.9 ±4.5 50.5 ±7.2* 58.7 ±6.7*# 38.873 ＜0.001左心房血栓(n) 0 1 0 2.231 0.328瓣膜病病因(n)風濕性/退行性變 13/7 15/5 17/3 2.133 0.344術(shù)前用藥(n)洋地黃 12 15 16 2.134 0.344鈣通道拮抗劑 3 3 4 0.235 0.889血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑男/女(n)1.078 0.583 6 5 8

2.2 患者左心房組織中Syndecan-4的表達水平與對照組相比，PaAF組和PeAF組Syndecan-4蛋白表達水平明顯下調(diào)(分別為 P=0.013和 P=0.01);與SR組相比，PaAF組和PeAF組Syndecan-4也明顯降低(分別為P=0.047和P=0.029)。但PeAF組和PaAF組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.893)，對照組和SR組之間差異也無統(tǒng)計學意義(P=0.131)。見圖 1，表 2。

圖1 各組瓣膜病患者Syndecan-4蛋白表達水平Figure 1 Expression of the Syndecan-4 protein in the four groups of patients

表2 瓣膜病患者Western blot檢測蛋白條帶灰度值()Table 2 The gray level of the protein bands detected by Western blot()

表2 瓣膜病患者Western blot檢測蛋白條帶灰度值()Table 2 The gray level of the protein bands detected by Western blot()

與對照組比較，*P ＜0.05;與 SR 組比較，#P ＜0.05

組別 Syndecan-4/β-actin iNOS/β-actin HMGB1/β 0.99 ±0.09 1.02 ±0.12 0.46 ±0.06 SR 組 0.93 ±0.06 1.06 ±0.11 0.45 ±0.07 PaAF 組 0.72 ±0.1*# 1.61 ±0.10*# 0.63 ±0.05*#PeAF 組 0.60 ±0.12*# 1.67 ±0.08*# 0.95 ±0.10*#-actin對照組

Syndecan-4蛋白水平與 EF值、受累瓣膜數(shù)、NYHA分級的相關(guān)分析顯示:在瓣膜病患者中，Syndecan-4蛋白水平和EF值無相關(guān)關(guān)系(r=－0.012，P=0.211);Syndecan-4 蛋白水平與受累瓣膜數(shù)無相關(guān)關(guān)系(r=0.001，P=0.488);Syndecan-4蛋白水平與NYHA分級負相關(guān)(r=－0.157，P=0.045)。進一步分析顯示:NYHA分級Ⅲ、Ⅳ級患者左心房組織中的Syndecan-4蛋白水平與I級相比明顯降低(分別為 P=0.001和 P ＜0.001)，Ⅲ、Ⅳ級與Ⅱ級相比差異有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.037和P=0.005)，但Ⅰ級和Ⅱ級之間、Ⅲ級和Ⅳ級之間差異均無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.054和P=0.062)。見圖 2。

2.3 房顫患者左心房組織中炎癥反應(yīng) HE染色顯示PaAF組、PeAF組比對照組、SR組有更多的炎癥細胞浸潤。見圖3。

Western blot檢測左心房組織中炎癥標記物iNOS和HMGB1表達水平的結(jié)果顯示:PaAF組和PeAF組iNOS表達水平較對照組明顯升高(分別為P=0.011和P ＜0.001)，較SR 組也明顯升高(分別為P=0.02和 P ＜0.001)，但 PaAF組和 PeAF組之間，對照組和SR組之間差異均無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.065和 P=0.0783);PaAF組和 PeAF組HMGB1表達水平較對照組明顯升高(分別為P=0.018和 P ＜0.001)，較 SR 組也明顯升高(分別為P=0.023 和 P=0.009);與 iNOS 不同的是，HMGB1表達水平PeAF組較PaAF組有較明顯的升高(P=0.027)。見圖 4，表 2。

圖2 Syndecan-4蛋白水平和各組瓣膜病患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系Figure 2 Correlation of the expression of Syndecan-4 with other clinical parameters of the four groups of patients

圖3 各組瓣膜病患者炎癥細胞浸潤(HE×200)Figure 3 Infiltration of inflammatory cells in the four groups of patients by HE staining(HE×200)

圖4 各組左心房組織中的炎癥標記物表達Figure 4 Expressions of inflammation markers in the left atrial tissue of the four groups of patients

3 討 論

炎癥反應(yīng)與房顫的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及持續(xù)有關(guān)，研究表明炎癥因子 IL-6、IL-8、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-7(monocyte chemotactic protein-7，MCP-7)等參與房顫的發(fā)生與發(fā)展［8］。iNOS是一種早期的炎癥標記物，參與誘導促炎細胞因子釋放和氧化應(yīng)激的發(fā)生過程［9］。HMGB1是一種核蛋白質(zhì)，由壞死細胞以及活化的免疫細胞釋放至細胞外，具有細胞因子的活性，繼之啟動免疫反應(yīng)和引發(fā)炎性反應(yīng)，是新發(fā)現(xiàn)的炎癥晚期細胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HMGB1在房顫患者血清中濃度明顯升高［10］。本研究觀察到:與竇性心律組相比，持續(xù)性房顫組和陣發(fā)性房顫組患者的左心房組織中HMGB1和iNOS均表達上調(diào)，且HMGB1含量持續(xù)性房顫組高于陣發(fā)性房顫組。上述結(jié)果提示HMGB1和iNOS可能通過誘導炎癥反應(yīng)參與房顫的發(fā)生，但房顫時引起炎癥反應(yīng)增加的原因尚不清楚。

Syndecan是大多數(shù)哺乳動物細胞表面主要的硫酸肝素類蛋白多糖，在炎癥反應(yīng)、血管新生、組織重構(gòu)等防御機制中發(fā)揮重要作用。大量研究表明Syndecan可監(jiān)控炎癥的進程，Rodrigo等［11］報道 Syndecan-1敲除小鼠隨著IL-6表達上調(diào)，表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)增強和恢復功能受損;Wang等［12］使用葡聚糖硫酸鈉誘導建立小鼠大腸炎模式，注射低分子量肝素后表現(xiàn)出抑制小鼠Syndecan-1的脫落而緩解大腸炎癥;我們前期的研究發(fā)現(xiàn)過表達Syndecan-4可減輕心梗后炎癥反應(yīng)［7］;而Syndecan-4缺乏小鼠注射脂多糖后，轉(zhuǎn)化生長因子-β1功能受損，表現(xiàn)出較高的死亡率［13］;這些證據(jù)表明Syndecan-4低表達或脫落能夠促進不同器官的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)房顫患者較對照組Syndecan-4表達明顯降低，伴隨炎癥細胞的浸潤程度增加，且NYHA分級Ⅲ、Ⅳ級的患者Syndecan-4表達較Ⅰ、Ⅱ級患者明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。與本研究結(jié)果相似，Strand與Takahashi等［14－15］觀察到衰竭的心臟組織及血清中Syndecan-4的脫落增加，提示房顫和心衰發(fā)生過程中Syndecan-4可能有相同的調(diào)節(jié)機制。

綜上所述，房顫患者左心房組織中Syndecan-4表達明顯下降伴隨大量的炎癥細胞浸潤以及炎癥標記物HMGB1和iNOS的高表達，提示Syndecan-4脫落可能是房顫患者左心房組織中炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的潛在機制。

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