低劑量率中子-伽瑪射線混合照射對大鼠肝細胞CYP7A1基因mRNA表達的影響

歐陽可漢 沈先榮, 何 穎

1（海軍工程大學(xué)核能科學(xué)與工程系 武漢 430033）

2（海軍醫(yī)學(xué)研究所 上海 200433）

低劑量率電離輻射對健康的影響是學(xué)術(shù)界和公眾十分關(guān)注的問題。而在一些存在放射性的工作場所中，如核電站，存在中子-γ射線混合照射。研究低劑量率中子-γ射線混合照射對機體的影響對維護職業(yè)受照人群的健康具有重大意義。Wong等[1]研究發(fā)現(xiàn)原子彈爆炸幸存者的血清膽固醇水平相對較高，認(rèn)為其與電離輻射水平相關(guān)。膽固醇代謝異常將導(dǎo)致一些疾病的產(chǎn)生，比如動脈粥樣硬化等心血管疾病，阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2-3]。肝臟作為唯一能夠?qū)Ⅲw內(nèi)過多的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的器官，對膽固醇代謝起著至關(guān)重要的作用。肝臟的膽固醇代謝異常將導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，比如膽汁淤積、黃疸病、膽結(jié)石，使肝功能出現(xiàn)大范圍異常[4-5]。同時膽固醇代謝和其他一些物質(zhì)（葡萄糖、脂肪酸）的代謝途徑還存在相互交叉。因此，當(dāng)一個代謝系統(tǒng)被擾亂，將會出現(xiàn)更大范圍的異常。故低劑量率電離輻射對機體膽固醇代謝的作用及其機制值得深入研究。

膽固醇 7α-羥化酶(CYP7A1)是膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸經(jīng)典途徑的主要限速酶，它在膽固醇代謝中起著重要的作用[6]。本研究采用低劑量率中子-γ射線混合照射大鼠，在照射14 d(γ射線累積照射劑量為 0.4676 Gy、中子累積照射劑量為 7.84 mGy)和31 d(γ-射線累積照射劑量為1.0354 Gy、中子累積照射劑量為17.36 mGy)后采集樣本，運用實時熒光定量PCR法對肝臟細胞CYP7A1基因及調(diào)控其表達的核轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平進行檢測。旨在研究低劑量率中子-γ射線混合照射對大鼠膽固醇分解代謝關(guān)鍵分子膽固醇 7α-羥化酶(CYP7A1)基因表達的影響，并初步探討其可能機制，為闡明低劑量率中子-γ射線混合照射對膽固醇代謝影響的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

BIO RAD Chromo 4實時熒光定量PCR儀、Trizol reagent (Invitrogen 公司)、SYBR Green Premix Ex TapTM(TaKaBa,寶生物工程大連有限公司)、微量紫外分光光度計 NanoDrop 1000(Thermo 公司)、DL2000 Marker、瓊脂糖。

1.2 動物分組及處理

購買雄性Wistar大鼠60只（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司），動物飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學(xué)研究所。編號后按隨機數(shù)字表法分為4組：(1)14 d后處死的空白對照組10只；(2)14 d后處死的混合照射組20只；(3)31 d后處死的空白對照組10只；(4)31 d后處死的混合照射組20只。照射組在海軍醫(yī)學(xué)研究所輻照室進行照射，照射條件為：與60Co源距離為4.38 m，γ射線照射劑量率為0.0167 Gy·h-1，每天照射2 h，同時與252Cf源距離為0.75 m，中子劑量率0.028 mGy·h-1，每天照射20 h。期間動物自由飲食飲水。在照射14 d (γ射線累積照射劑量0.4676 Gy、中子累積照射劑量7.84 mGy)、31 d (γ射線累積照射劑量1.0354 Gy、中子累積照射劑量17.36 mGy)后，馬上處死空白對照組大鼠10只、混合照射組大鼠 20只。迅速取出肝臟，制成單細胞懸液，PPS洗2次后備用。

1.3 肝臟總RNA的提取及cDNA合成

采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定 260nm與 280nm處吸光度(A)的比值，即A260/A280，然后進行總 RNA定量，-80℃下冷凍備用。cDNA合成是按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行，取5000 ng的總RNA，加20 μL的試劑，再加雙蒸水至總體積為100 μL。

1.4 實時定量 PCR引物的設(shè)計合成

根據(jù)GenBank中基因信息，應(yīng)用Primer Primer 5軟件設(shè)計用于實時定量PCR實驗檢測的目的基因和內(nèi)參基因引物序列。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，并且純化質(zhì)檢合格，具體信息見表 1。

表1 用于實時定量PCR測定的基因引物序列Table 1 Primers of genes used for RT-PCR

1.5 實時定量PCR檢測基因表達

先分別對14 d和31 d樣品進行混裝：10只空白對照組大鼠的cDNA等量混裝成為3管，其中2管是由隨機選取的等量的3只大鼠的cDNA樣本混合，1管是由等量的4只大鼠的cDNA樣本混合；20只混合照射組大鼠的cDNA等量混裝成為6管，其中4管是由隨機選取的等量的3只大鼠的cDNA樣本混合，2管是由隨機選取的等量的4只大鼠的cDNA樣本混合。PCR實驗時每個樣品設(shè)立3個平行孔。用實時定量PCR試劑盒，以不同濃度梯度的cDNA樣本，分別建立目的基因和內(nèi)參基因(β-actin)擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷實時定量 PCR的擴增效率。采用優(yōu)化條件中達到最佳擴增效率的cDNA樣本和引物量進行檢測[7]。20 μL反應(yīng)體系中包括：SYBR 10 μL,雙蒸水 8 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA樣本 1 μL。PCR 擴增條件為 95 ℃ 預(yù)變性 3 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s的條件下循環(huán) 41次，每次循環(huán)結(jié)束后進行熒光檢測。擴增結(jié)束后于1 ℃的梯度逐步升溫至 95 ℃進行熔解曲線分析，確定擴增產(chǎn)物的特異性。

1.6 實時定量PCR數(shù)據(jù)分析

分別測定每個樣本的目的基因和內(nèi)參基因(βactin)擴增的 Ct值，然后采用相對定量方法分析每個樣本目的基因的 ΔCt值(ΔCt值=目的基因 Ct值-內(nèi)參基因Ct值)，再依據(jù)ΔΔCt(實驗組ΔCt-對照組ΔCt)計算出 2-ΔΔCt。當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率接近時，2-ΔΔCt的值就表示實驗組樣本中的目的基因相對于對照組樣本中的目的基因轉(zhuǎn)錄水平變化倍數(shù)[7]。以靶基因相對表達變化2倍以上為有差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝臟總RNA質(zhì)量

各樣本的總 RNA 其 A260/A280都在 1.8-2.0之間，純度較好。隨機挑選的6個樣品的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖（圖 1）有清晰的三條帶。故提取的各樣本總RNA質(zhì)量合格。

圖1 樣品總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Gel images of the total RNA of liver samples

2.2 實時定量 PCR擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)和產(chǎn)物的確定分析

β-actin、CYP7A1、PXR、LXR、PPARα、FXR、HNF4α基因擴增曲線正常(R2為 0.995-0.999)擴增效率為95%-105%。結(jié)果說明，實時定量PCR檢測系統(tǒng)建立成功且準(zhǔn)確可靠，完全滿足實時定量PCR檢測優(yōu)化條件，可以應(yīng)用相對定量 2-ΔΔCt方法進行分析計算。熔解曲線分析顯示基因的熔解曲線峰形均單一銳利，說明擴增產(chǎn)物無非特異信號干擾，擴增反應(yīng)具有較好的特異性（圖2）。瓊脂凝膠電泳顯示所得擴增產(chǎn)物均為目的條帶(圖3)。

圖2 基因的熔解曲線：上排從左到右依次為β-actin、CYP7A1、PXR和FXR，下排從左到右為LXRα、HNF4α和PPARαFig.2 Dissociation curves of genes. From the left to the right are β -actin, CYP7A1, PXR, FXR in the upper row and LXRα, HNF4α, and PPARα in the bottom row

圖3 基因的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳M: DNA marker DL2000；1: β-actin(受照 14 d 后的樣品)；2: β-actin(受照 31 d 后的樣品)；3: CYP7A1(受照 14 d 后的樣品)；4: CYP7A1(受照31 d后的樣品)；5: PXR(受照14 d后的樣品)；6: PXR(受照31 d后的樣品)；7: FXR(受照 14 d 后的樣品)；8: FXR (受照 31 d 后的樣品)；9: LXRα(受照14 d后的樣品)；10: LXRα (受照31 d后的樣品)；11: HNF4 α (受照 14 d 后的樣品)；12: HNF4α (受照 31 d后的樣品)；13: PPARα (受照14 d后的樣品)；14:PPARα (受照31 d后的樣品)Fig.3 Gel images of the PCR products of genes. M: DNA marker DL2000; 1: β-actin(sample was irradiated for 14 d);2: β-actin(sample was irradiated for 31 d);3:CYP7A1(sample was irradiated for 14 d); 4: CYP7A1(sample was irradiated 31 d); 5: PXR(sample was irradiated for 14 d); 6: PXR(sample was irradiated for 31 d); 7:FXR(sample was irradiated for 14 d); 8: FXR(sample was irradiated for 31 d); 9: LXRα (sample was irradiated for 14 d); 10: LXRα (sample was irradiated for 31 d); 11: HNF4α(sample was irradiated for 14 d); 12: HNF4 α (sample was irradiated for 31 d); 13: PPARα (sample was irradiated for 14 d); 14: PPARα (sample was irradiated for 31 d);

2.3 低劑量率中子-γ射線混合照射后大鼠肝細胞CYP7A1基因mRNA表達的變化

圖4 顯示各基因表達的檢測結(jié)果，表明大鼠肝臟于全身混合照射14 d和31 d后基因擴增曲線良好。將空白對照組肝細胞CYP7A1基因mRNA表達水平設(shè)為 1，并據(jù)此確定混合照射組肝細胞CYP7A1基因mRNA的相對表達量。表2所列為用實時熒光定量 PCR 技術(shù)檢測得到的各基因的Ct值、ΔCt值(ΔCt值=目的基因 Ct值一內(nèi)參基因Ct值)，再依據(jù)ΔΔCt(實驗組ΔCt-對照組ΔCt)計算出相對表達倍數(shù)2-ΔΔCt。圖5顯示，在受照14 d后(γ射線累積照射劑量為0.4676 Gy、中子累積照射劑量為 7.84 mGy)，混合照射組大鼠肝細胞CYP7A1基因 mRNA表達下調(diào)至空白對照組的44% (p<0.01)，有非常顯著差異；在受照31 d后(γ射線累積照射劑量為1.0354 Gy、中子累積照射劑量為 17.36 mGy)，混合照射組大鼠肝細胞CYP7A1基因 mRNA表達下調(diào)至空白對照組的22% (p<0.01)，有非常顯著差異。在一定時期內(nèi)，大鼠肝細胞CYP7A1基因mRNA表達隨著受照劑量的增加而顯著下降。

圖4 照射14 d和31 d后大鼠肝臟基因表達實時定量PCR檢測的擴增曲：左邊為照射14 d后的樣本，右邊為照射31 d后的樣本：從上至下依次為CYP7A1+ β-actin、PPARα+ β-actin、FXR+ β-actin、PXR+ β-actin、LXRα+ β-actin、HNF4α+ β -actinFig.4 Amplification curves of genes in liver assayed with RT-qPCR after radiated for 14 d and 31 d, respectively.Samples radiated for 14 d on the left side and samples radiated for 31 d on the right side. From up to down are CYP7A1+ β-actin, PPARα+ β-actin, FXR+ β-actin,PXR+ β-actin, LXRα+ β-actin, and HNF4α+ β-actin.

表2 照射后各基因mRNA表達水平Table 2 The mRNA level of the genes after radiated

圖5 CYP7A1基因mRNA相對于內(nèi)參β-actin基因mRNA的表達水平，將空白對照組肝細胞CYP7A1基因mRNA表達水平設(shè)為1，**, p<0.01Fig.5 CYP7A1 mRNA gene expression in the liver. Results are expressed as a ratio to β-actin mRNA level. The mRNA levels of control rats were arbitrarily set at 1, **, p < 0.01

2.4 低劑量率中子-γ射線混合照射后大鼠肝細胞中調(diào)控CYP7A1基因的核受體mRNA表達的變化

如圖6所示，在照射14 d (γ射線累積照射劑量為0.4676 Gy、中子累積照射劑量為7.84 mGy)后，PPARα基因mRNA表達上調(diào)至空白對照組的1.45倍，F(xiàn)XR基因mRNA表達上調(diào)至空白對照組的1.14倍，LXRα基因 mRNA表達下調(diào)至空白對照組的89%，HNF4α基因mRNA表達下調(diào)至空白對照組的95%，PXR基因 mRNA表達上調(diào)至空白對照組的1.69倍。在照射31 d (γ射線累積照射劑量1.0354 Gy、中子累積照射劑量為17.36 mGy)后，與空白對照組比較，PPARα基因 mRNA表達上調(diào)至空白對照組的1.32倍；FXR基因mRNA表達下調(diào)至空白對照組的68%；LXRα基因mRNA表達分別上調(diào)至空白對照組的1.40倍；HNF4α基因mRNA表達下調(diào)至空白對照組的87%；PXR基因mRNA表達上調(diào)至空白對照組的 2.34倍(p<0.01)。統(tǒng)計分析結(jié)合實時定量PCR方法，以相對表達變化2倍以上認(rèn)為有差異，數(shù)據(jù)表明，受照14 d和31 d后，與空白對照組比較，LXRα、PPARα、HNF4α及FXR基因mRNA相對表達量無明顯變化。但是在受照31 d后，與相應(yīng)的空白對照組比較，混合照射組大鼠肝細胞PXR基因mRNA表達上調(diào)非常顯著(p<0.01)。

圖6 肝臟中調(diào)控CYP7A1 基因mRNA 表達的核受體mRNA 相對于內(nèi)β-actin 參基因mRNA 的表達水平，將空白對照組的各基因mRNA 表達水平設(shè)為1, **, p<0.01Fig.6 The mRNA level of the nuclear receptors that could regulate the transcription of CYP7A1 gene in the liver.Results are expressed as a ratio to β-actin mRNA level. The mRNA levels of control rats were arbitrarily set at 1, **, p < 0.01

3 討論

小劑量低劑量率電離輻射所致的人體效應(yīng)越來越受到人們的關(guān)注。膽固醇代謝作為健康的一部分，它的異常將會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，比如膽石病[8]。對于小劑量電離輻射對膽固醇代謝造成的影響，國內(nèi)外進行的研究相對較少，尤其是低劑量率中子-γ射線混合照射研究。本文主要研究了在低劑量率中子-γ射線混合照射下肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的主要限速酶CYP7A1基因mRNA表達的變化。研究發(fā)現(xiàn)：在照射14 d (γ射線累積照射劑量為0.4676 Gy、中子累積照射劑量為7.84 mGy)和31 d (γ射線累積照射劑量為1.0354 Gy、中子累積劑量為17.36 mGy)后，混合照射組大鼠肝細胞 CYP7A1基因 mRNA表達分別下調(diào)至空白對照組的44% (p<0.01)和22%(p<0.01)。說明低劑量率γ和中子混合照射在照射一段時期內(nèi)對大鼠肝細胞 CYP7A1 mRNA相對表達水平有著顯著的影響。

肝臟膽固醇 7α-羥化酶(CYP7A1)基因 mRNA的表達受各種核受體和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。肝X受體α(LXRα)、過氧化物酶體增值物激活受體α(PPARα)、肝細胞核因子 4α(HNF4 α)都能夠刺激上調(diào) CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄表達，而法尼醇 X受體(FXR)、孕烷受體(PXR)能夠抑制CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄表達。肝 X 受體(LXRα)能被配體氧化型固醇激活，并且它能夠和維甲酸受體α (RXRα)結(jié)合后形成異源二聚體，異源二聚體 LXRα-RXRα將與CYP7A1基因啟動子區(qū)的siteI位點結(jié)合，進而調(diào)控CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄[9]。Zhang等[10]給野生型和LXRα基因敲除的 C57BL/6J老鼠喂食 LXRα激活劑，發(fā)現(xiàn)野生型老鼠CYP7A1基因mRNA表達顯著增加，但LXRα基因敲除老鼠觀察不到明顯變化。研究表明HNF4α是CYP7A1基因的重要調(diào)控因子，它能夠與位于CYP7A1基因啟動子區(qū)膽汁酸響應(yīng)元件II(BAREII)的DR-1序列結(jié)合，進而促進CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄。另外，如果HNF4α結(jié)合位點發(fā)生突變，CYP7A1基因啟動子活性將會顯著下降，表明HNF4α對于 CYP7A1基因轉(zhuǎn)錄的基本水平至關(guān)重要[11]。Cheema等研究發(fā)現(xiàn)，PPARα被配體激活后，能夠與 RXRα結(jié)合形成 PPARα-RXRα二聚體，PPARα-RXRα能夠與CYP7A1啟動子區(qū)siteI位點結(jié)合，進而調(diào)控CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄[12]。石如玲等[13]通過鄰苯二甲酸二異辛酯激活大鼠PPARα的表達，發(fā)現(xiàn)肝臟中CYP7A1基因表達加強。Cao等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃連生物堿提取物能夠通過上調(diào)CYP7A1基因正向調(diào)控因子PPAR α表達，而使CYP7A1基因表達上調(diào)，最終導(dǎo)致高脂質(zhì)膳食的大鼠肝臟中膽固醇濃度降低。FXR能夠通過 FXR-SHP、FXR-FGF15途徑來抑制 CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄。肝同系物受體1(LRH-1) 是促進 LXRα激活 CYP7A1基因轉(zhuǎn)錄的輔助因子[15]。在肝臟中，膽汁酸能夠激活FXR，而后 FXR調(diào)控異源二聚體小分子伴侶(small heterodimer partner，SHP)轉(zhuǎn)錄，SHP會和LRH-1結(jié)合成異源二聚體，導(dǎo)致CYP7A1基因啟動子募集的輔助激活因子減少，CYP7A1基因轉(zhuǎn)錄下降。另外，F(xiàn)XR被激活后，大鼠纖維母細胞生長因子FGF15的分泌和表達將增加，而FGF15將與FGFR4結(jié)合，從而激活JNK途徑，使CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄表達受到抑制[16]。與正常小鼠相比，PXR基因敲除的小鼠CYP7A1基因的表達減少近2倍。另外，對小鼠喂食 PCN后，發(fā)現(xiàn)它能夠顯著抑制 CYP7A1基因mRNA的水平[17]。但是PXR基因敲除的小鼠，PCN對其CYP7A1基因表達的抑制作用將失效。故PXR能夠通過減少其基礎(chǔ)表達和抑制其表達兩方面使CYP7A1基因表達失調(diào)[18]。Jonker等[19]研究發(fā)現(xiàn)PXR能夠抑制CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄，使PXR能夠成為治療膽固醇代謝異常疾病的靶標(biāo)。

為了研究實驗對照組 CYP7A1 mRNA變化可能機制，我們同樣運用了實時定量 PCR法檢測了LXRα、PPARα、HNF4α、FXR、PXR基因mRNA的相對表達水平，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)混合照射組LXRα、PPARα、HNF4 α、FXR 基因 mRNA 的表達水平相對于空白對照組無明顯變化。但是在照射14 d后，混合照射組大鼠肝細胞PXR基因mRNA表達上調(diào)至相應(yīng)空白對照組的1.69倍。在照射31 d后，混合照射組大鼠肝細胞PXR基因mRNA表達上調(diào)至相應(yīng)空白對照組的 2.34倍(p<0.01)，有非常顯著差異。故CYP7A1 mRNA表達下調(diào)可能機制是混合照射在一段時期內(nèi)上調(diào)了其負(fù)調(diào)控基因 PXR mRNA的表達。

另外，除了各種核受體和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，CYP7A1 mRNA表達水平還受到其它因素的影響。Park等[20]發(fā)現(xiàn)對C57BL/6鼠注射胰島素后，肝細胞SHP基因mRNA表達上升，且胰島素誘導(dǎo)級聯(lián)信號通路使胰島素β細胞轉(zhuǎn)錄因子(FOXO1)失活，進而使CYP7A1基因的表達受到抑制。Kim等[21]研究發(fā)現(xiàn)在正常和受壓狀態(tài)下，抑癌因子P53都能通過增加SHP量來降低 CYP7A1水平。Henkel等研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)喂食FVB/NJ小鼠膽固醇膳食12周能夠誘導(dǎo)肝細胞腫瘤壞死因子α (TNF α)和白介素 1β(IL-1β)表達，而該 2種因子能夠通過各自的途徑對CYP7A1的表達進行負(fù)向調(diào)控[22]。對于小劑量的低劑量率中子-γ射線混合照射對CYP7A1基因mRNA表達造成的影響可能是多因素共同作用的，為了更加深入、全面的解釋其機制還需進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量率中子-γ射線混合照射一段時期后，大鼠肝細胞 CYP7A1基因 mRNA表達顯著下調(diào)，而它的負(fù)調(diào)控基因PXR基因mRNA表達明顯上升。故一定時期內(nèi)低劑量率中子-γ射線混合照射可能通過顯著上調(diào)大鼠肝細胞 PXR基因mRNA表達而使肝細胞CYP7A1基因mRNA表達下降。但是肝細胞CYP7A1基因mRNA表達顯著下降可能不是單一因素造成的，還有其他因素的共同作用，這一點尚需進一步研究。

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