BRAF T1799A基因突變甲狀腺乳頭狀癌超聲特征

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266003)

BRAF T1799A基因突變甲狀腺乳頭狀癌超聲特征

叢小飛，趙世華，王顏剛，王萍，劉鑫

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266003)

目的研究甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中BRAF T1799A突變與結(jié)節(jié)超聲特征之間的關(guān)系。方法選擇行甲狀腺切除的PTC病人160例，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)及DNA直接測序法檢測新鮮組織標(biāo)本中BRAF T1799A基因突變情況，結(jié)合甲狀腺超聲檢查結(jié)果分析BRAF T1799A基因突變與結(jié)節(jié)邊界、鈣化、血流、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及結(jié)節(jié)大小等超聲特征的關(guān)系。結(jié)果160例PTC病人中，BRAF T1799A突變陽性者46例，突變率為28.75%。BRAF T1799A突變陽性病人血流豐富的比例大于陰性者(χ2=4.88，P<0.05)；Logistic回歸分析顯示，血流豐富與BRAF T1799A突變呈正相關(guān)(OR=3.368，P<0.01)；BRAF T1799A突變陽性組與陰性組其他超聲特征比較差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)TC組織中BRAF T1799A基因突變與結(jié)節(jié)血流關(guān)系密切，而與其他超聲特征無明顯相關(guān)性。

甲狀腺腫瘤；BRAF；突變；超聲檢查

近幾年來，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中的BRAF T1799A突變受到廣泛關(guān)注，現(xiàn)已明確該突變通過持續(xù)激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1]，且與PTC甲狀腺包膜外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期等特征密切相關(guān)，通過多種分子機(jī)制影響甲狀腺腫瘤的生長方式。作為一種新的分子標(biāo)志物，BRAF T1799A突變在PTC的輔助診斷、預(yù)后評估、指導(dǎo)治療等方面起著重要作用[2]。研究結(jié)果已表明，PTC中BRAF T1799A突變與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)過量表達(dá)密切相關(guān)，且在PTC中發(fā)現(xiàn)了不同頻率的表皮生長因子受體(EGFR)的突變[3]，而VEGF與EGFR的過量表達(dá)通過多種途徑共同參與腫瘤血管的生成過程, 在腫瘤生長、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。以上機(jī)制很有可能通過BRAF T1799A突變而引起PTC結(jié)節(jié)生長方式的改變，因此，本研究旨在探討B(tài)RAF T1799A突變與PTC結(jié)節(jié)超聲特征的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象

選擇2011—2013年于我院行甲狀腺切除術(shù)的PTC病人160例，其中男38例，女122例；平均年齡為(45.73±13.83)歲。病人均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。標(biāo)本采集和病例收集經(jīng)過病人知情同意。癌結(jié)節(jié)按大小分為3級，<1 cm為微小癌，1～3 cm為中等大小癌，>3 cm為大結(jié)節(jié)癌；結(jié)節(jié)邊界分為清晰和欠清晰；回聲分為高、低及混合回聲；鈣化情況分為有和無鈣化；血流根據(jù)結(jié)節(jié)內(nèi)部及周邊的分布情況分為豐富(3個(gè)以上點(diǎn)狀血流、條狀血流信號、高阻動脈血流信號)和不豐富(血流分布未見異常、1～2個(gè)點(diǎn)狀血流)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腺體外浸潤分為有和無轉(zhuǎn)移或浸潤。

1.2方法

1.2.1DNA提取和PCR擴(kuò)增 收集術(shù)后新鮮甲狀腺癌組織標(biāo)本50 mg，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書中的步驟提取各樣本中的基因組DNA，取基因組DNA 2 μL,用紫外線分光光度計(jì)檢測樣本吸光度(A)值，以測定所提取DNA的濃度和純度，所得合格DNA放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎闷胀≒CR方法對BRAF基因第15外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因片段為：ATATATTTCTTCAT-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTT-GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGT-GGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-TCCATTTTGTGGATG，其上游引物序列：5′-GCT-TGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物序列：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′。

1.2.2產(chǎn)物測序 PTC的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測序，分析各樣本中有無BRAF T1799A突變。

1.2.3B超資料的分析 對160例病人的B超資料,包括癌結(jié)節(jié)邊界、回聲、鈣化、血流及結(jié)節(jié)數(shù)量、淋巴結(jié)大小、結(jié)節(jié)大小及腺體外浸潤情況等超聲表現(xiàn)進(jìn)行分析。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間超聲特征差異比較采用卡方檢驗(yàn), BRAF T1799A與超聲表現(xiàn)的相關(guān)性采用Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

本文160例PTC標(biāo)本中BRAF T1799A突變陽性者46例，陰性者114例，陽性率為28.75%(圖1、2)。BRAF T1799A突變陽性與陰性組年齡分別為(47.85±12.94)、(44.88±14.15)歲，BRAF T1799A突變陽性組男女分別為9、41例，BRAF T1799A突變陰性男女分別為29、81例，兩組年齡、性別相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BRAF T1799A突變陽性組血流豐富的比例明顯高于陰性組(χ2=4.88，P<0.05)。見表1。Logistic回歸分析顯示，血流豐富與BRAF T1799A突變間呈正相關(guān)(OR=3.368，P<0.01)，與結(jié)節(jié)的邊界、回聲、鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腺體外浸潤等超聲特征均無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

圖1 BRAF第15外顯子1799位點(diǎn)基因分析圖譜

圖2 BRAF第15外顯子1799位點(diǎn)T-A基因突變分析圖譜

組別邊界清晰模糊回聲高低混合鈣化有無血流豐富否多結(jié)節(jié)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無腺體外浸潤有無結(jié)節(jié)大小小中大陽性133714723713272325252129113916286陰性3971710218525397156543476308034733

3 討 論

PTC是甲狀腺癌中最常見的一種類型，而BRAF T1799A突變主要發(fā)生于PTC，國內(nèi)外報(bào)道的突變率為28%～83%[5-6]，本研究的突變率為28.75%，處在較低水平。BRAF基因是RET和RAS的下游蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路關(guān)鍵成分，其突變可持續(xù)激活MAPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，形成腫瘤[7]。很多研究證實(shí)，BRAF T1799A突變與高侵襲性的臨床及病理特征密切相關(guān)，如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺體外浸潤、腫瘤分期等。XING等[8]研究認(rèn)為,檢測細(xì)針穿刺樣本的BRAF T1799A突變情況可有助于甲狀腺癌的診斷，經(jīng)細(xì)胞學(xué)診斷為PTC的病人應(yīng)在手術(shù)前檢測其穿刺樣本的BRAF T1799A突變情況,以指導(dǎo)手術(shù)方式。由此可見，BRAF T1799A突變在PTC中具有獨(dú)特而重要的地位。

隨著超聲顯像成為甲狀腺腫瘤的主要診斷手段，二者的關(guān)系也受到關(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道，存在BRAF T1799A突變的PTC傾向于結(jié)節(jié)前后徑大于橫徑，鈣化的發(fā)生率也相對較高，但數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9]，國內(nèi)外對BRAF T1799A突變與結(jié)節(jié)大小關(guān)系的結(jié)論尚不一致[10-11]。本研究結(jié)果顯示，BRAF T1799A突變與結(jié)節(jié)大小無相關(guān)性，與國內(nèi)

表2 BRAF突變陽性與陰性組多因素Logistic回歸分析

報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，BRAF T1799A突變陽性與陰性組在結(jié)節(jié)邊界、回聲、鈣化、結(jié)節(jié)大小、腺體外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等超聲表現(xiàn)方面比較差異均無顯著性，提示PTC中BRAF T1799A突變陽性超聲表現(xiàn)尚無特異性。而Logistic多元逐步回歸分析顯示， BRAF T1799A突變與血流豐富相關(guān)，其機(jī)制尚不明確。有研究結(jié)果顯示，BRAF突變與VEGF的過量表達(dá)密切相關(guān)[12]，而VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤周圍血管新生內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、生存等過程，在腫瘤周圍血管生成中發(fā)揮重要的作用。XING等[13]研究顯示，EGFR在PTC中的突變率為5%，其突變與STAT、MAPK、PI3K/AKT活性增強(qiáng)密切相關(guān)。PTC組織中BRAF突變率高，EGFR突變與BRAF突變很可能具一定相關(guān)性。EGFR高表達(dá)可促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移, 抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。因此認(rèn)為，BRAF T1799A突變可能通過以上兩種機(jī)制引起結(jié)節(jié)周圍新生血管形成，使結(jié)節(jié)周圍血流信號增加，并增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性。但是，具體機(jī)制還需深入探索。此外，由于沒有進(jìn)行大樣本量的試驗(yàn)，且本研究中甲狀腺超聲檢查對結(jié)節(jié)血流結(jié)果的報(bào)告較粗略，沒有進(jìn)行分級，無具體血流阻力值，所以具有一定的局限性，未來還需要做更加細(xì)致的研究。本研究沒有發(fā)現(xiàn)其他超聲特征與BRAF T1799A突變有相關(guān)性，而很多研究證實(shí)BRAF T1799A突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期呈正相關(guān)，分析其原因可能為超聲對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢查不敏感，應(yīng)結(jié)合病理報(bào)告中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)果進(jìn)行分析。

綜上所述，認(rèn)為PTC中BRAF T1799A突變與結(jié)節(jié)血流具有相關(guān)性，可能會對甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺活檢起到提示作用，并通過檢測穿刺標(biāo)本的BRAF T1799A突變情況，指導(dǎo)手術(shù)方式，評估預(yù)后。但超聲尚不能準(zhǔn)確提示BRAF T1799A突變的存在，兩者應(yīng)有效結(jié)合，以更好地指導(dǎo)PTC的診斷和治療。

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(本文編輯 厲建強(qiáng))

ULTRASOUNDFEATURESOFBRAFT1799AGENEMUTATIONPAPILLARYTHYROIDCARCINOMA

CONGXiaofei,ZHAOShihua,WANGYan′gang,WANGPing,LIUXin

(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the correlation between BRAF T1799A gene mutation in tissue of papillary thyroid carcinoma (PTC) and the ultrasound features of the thyroid.MethodsOne hundred and sixty patients with PTC underwent thyroidectomy were enrolled in this study. Using polymerase chain reaction (PCR) and direct DNA sequencing, the BRAF T1799A gene mutation in fresh tissue samples was detected, which was analyzed by comparing with ultrasonographic results in terms of the boundary of nodules, calcification, blood supply, lymph node metastases and tumor size.ResultsOf the 160 patients,46 were BRAF T1799A positive, mutation rate being 28.75%. Those of positive BRAF T1799A showed a higher ratio of rich blood supply of their tumor samples than the negative ones (χ2=4.88,P<0.05). Logistic regression showed a positive correlation between BRAF T1799A mutation and rich blood flow (OR=3.368,P<0.01). The chi-square test showed no significant differences between BRAF T1799A mutation positive and negative groups in other sonographic features (P>0.05).ConclusionBRAF T1799A mutation in PTC is closely associated with the blood flow around the nodules but not with other sonographic features.

thyroid neoplasms; BRAF; mutation; ultrasonography

2013-08-31;

2014-03-01

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0266)

叢小飛(1986-)，女，在讀碩士研究生。

趙世華(1962-)， 男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

R736.1

A

1008-0341(2014)03-0210-03