雙黃通腑顆粒對(duì)大鼠腦出血水腫的治療作用

安斌 ，康旭卉 ，江運(yùn)超 ，曹峰 ，黃先茍 ，張衛(wèi)東 ，胡薇 ，夏敏 ，陳國(guó)華

雙黃通腑顆粒對(duì)大鼠腦出血水腫的治療作用

安斌1，康旭卉1，江運(yùn)超1，曹峰1，黃先茍1，張衛(wèi)東1，胡薇1，夏敏1，陳國(guó)華2

目的：研究雙黃通腑顆粒對(duì)腦出血大鼠腦水腫區(qū)腦含水量的變化以及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、水通道蛋白4（AQP4）表達(dá)的影響。方法：SD大鼠60只隨機(jī)分為藥物灌胃組和鹽水對(duì)照組各30只，用自體血注入法制作腦出血模型，術(shù)后第2天藥物灌胃組開(kāi)始灌入雙黃通腑顆粒藥液，對(duì)照組灌入等量生理鹽水。2組各分3、5、8 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死10只大鼠，測(cè)各組腦含水量，制作石蠟切片，用免疫組化方法觀察血腫周圍水腫區(qū)腦組織MMP9、AQP4的表達(dá)。結(jié)果：藥物灌胃組與鹽水對(duì)照組相比，腦含水量降低，腦組織血腫周圍水腫MMP9、AQP4表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論：雙黃通腑顆粒對(duì)大鼠腦出血后腦水腫具有治療作用。

雙黃通腑顆粒；腦出血；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；水通道蛋白4

入院的腦卒中患者中，10%～30%因腦出血入院，發(fā)病30 d內(nèi)死亡率高達(dá)30%～55%，存活者往往遺留嚴(yán)重的后遺癥。以往的研究發(fā)現(xiàn)腦出血在急性期死亡者，多在發(fā)病48 h內(nèi)由較大血腫的直接壓迫所致，而48 h后則大多為出血后的繼發(fā)損害引起顱內(nèi)壓持續(xù)性升高導(dǎo)致的腦疝所致，其中繼發(fā)性腦水腫起重要作用。近年來(lái)，一些研究表明，腦水腫的形成與一些因子的參與有密切的關(guān)系，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、水通道蛋白（aquaporin，AQP）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，其中又以MMP-9、AQP4與腦出血后腦水腫關(guān)系最為密切[1]。本研究以MMP-9、AQP4為切入點(diǎn)，研究雙黃通腑顆粒對(duì)大鼠腦出血腦水腫的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，由湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：NO.4304701841。術(shù)前平衡喂養(yǎng)7 d，保持干燥和空氣流通，溫度為（23±1）℃，濕度為（50±5）%，自由飲水。光照周期12 h以模擬正常晝夜生理節(jié)奏（7:00～19:00光照，19:00～7:00黑暗），術(shù)前禁食12 h。

1.1.2 主要藥品與試劑 雙黃通腑顆粒，為我院自制制劑，其組成為生大黃、人工牛黃、水牛角。其中生大黃、水牛角濃縮粉購(gòu)于華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)1203001S；人工牛黃購(gòu)于武漢百草園生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)120307。MMP-9多克隆抗體（ab38898，批號(hào) GR90412-1）、AQP4 多克隆抗體（ab46182，批號(hào)GR5865-1）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；免疫組化試劑盒、SABC試劑、DAB顯色試劑、多聚甲醛均購(gòu)于百奧斯公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型的制備 參照文獻(xiàn)自體血注入法[2]，10%水合氯醛（0.4m L/100 g）腹腔內(nèi)注射，麻醉后把大鼠固定在立體定向儀上，剔去頭頂?shù)拿怍?，頭部正中切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)約1.5mm，用鑷子分離骨膜，暴露前后囟門，調(diào)節(jié)定向儀使前后囟在同一水平面上，于前囟前0.2mm、中線右側(cè)旁開(kāi)3mm處用5mL注射器針頭鉆一直徑約1mm的小孔，不傷及硬腦膜，剪斷大鼠尾巴約2～3 cm，用試管采血，壓迫斷端并包扎，微量注射器抽取50μL未凝血，將微量注射器固定于立體定位儀上，垂直從鉆孔插入腦組織，深度為6mm，向右側(cè)尾狀核緩慢注入自體血，注完后留針15m in，緩慢退出微量注射器，用骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚，再次消毒，手術(shù)后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)，送至通風(fēng)和有空調(diào)的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 60只大鼠造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物灌胃組和鹽水對(duì)照組各30只。藥物灌胃組每天給予預(yù)先配好雙黃通腑顆粒藥液灌胃，依據(jù)成人劑量分別將生大黃、水牛角濃縮粉、人工牛黃按等效劑量比率換算為大鼠劑量[3]，每天給予生大黃0.045 g、水牛角濃縮粉0.018 g、人工牛黃0.009 g，加入6m L開(kāi)水溶解，冷卻后分3次灌入，鹽水對(duì)照組給予6m L生理鹽水，分3次灌入。

1.2.3 取材及處理 2組大鼠均分別灌胃3、5、8 d，在 3、5、8 d 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死（n=10）。大鼠測(cè)腦含水量直接斷頭處死，剝?nèi)⌒迈r腦組織，去除腦干后稱濕重，置恒溫干燥箱干燥（100℃，24 h），取出后稱干重（n=4）。其余大鼠先剪開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室插管，分別用生理鹽水及4%多聚甲醛灌注，大鼠僵硬后斷頭取腦，浸泡于4%多聚甲醛4℃，固定24 h，進(jìn)行石蠟包埋和切片，進(jìn)行免疫組化染色（n=6）。切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫苯至水，PBS漂洗5m in×3 次；3%H2O2，室溫 10min，避光以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次；修復(fù)24min以暴露抗原，室溫冷卻后滴加正常山羊封閉血清，室溫30min，甩去多余液體，不洗；加1∶100 AQP4或MMP-9多克隆抗體，于4℃過(guò)夜，0.01mol/L磷酸緩沖液PBS漂洗5min×3次；加生物素標(biāo)記的二抗，于37℃濕盒中孵育30min；0.01mol/L磷酸緩沖液PBS漂洗5m in×3次；滴加試劑抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物底物，于37℃濕盒中孵育20min；0.01mo1/L PBS 漂洗 5m in×4次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，透明，封片。每張切片用0.01mol/LPBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果分析 腦組織含水量=（腦組織濕重－腦組織干重）/濕重×100%。免疫組化切片在400倍顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行拍照，調(diào)整顯微鏡光源亮度，使之足夠白、亮。調(diào)整相機(jī)曝光時(shí)間，使背景呈現(xiàn)白色。在同樣的顯微鏡工作條件與相機(jī)工作條件一次拍攝完所有照片。每只動(dòng)物觀察3張切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取4個(gè)不同視野進(jìn)行觀察拍照，保存為JPG文件。用Image-Pro Plus 5.1軟件對(duì)照片文件進(jìn)行分析，測(cè)定血腫周圍組織中陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的積分光密度（integral optical density，IOD），取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）(x±s)表示，t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦水含量比較

藥物灌胃組在腦出血后第3、5、8天的腦含水量分別為（77.16±0.54）%、（72.53±0.27）%、（67.33±0.16）%，鹽水對(duì)照組在腦出血后第3、5、8天的腦含水量分別為（81.56±0.51）%、（75.76±1.05）%、（69.74±0.93）%；前者第 3、5、8天的腦含水量低于后者第3、5、8天的腦含水量（t=11.689，P＜0.05；t=5.911，P＜0.05；t=5.197，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血腫周圍組織中MMP-9、AQP4的表達(dá)

MMP-9、AQP-4染色陽(yáng)性表達(dá)均為棕黃色顆粒，MMP-9以細(xì)胞漿表達(dá)為主，AQP-4以細(xì)胞膜表達(dá)為主。腦出血后3 d鹽水對(duì)照組大鼠血腫周圍腦組織中MMP-9、AQP-4表達(dá)明顯增加，第5天緩慢下降，第8天仍高于正常水平。藥物灌胃組與鹽水對(duì)照組比較，第3、5、8天的血腫周圍腦組織中MMP-9、AQP-4表達(dá)均減少（P＜0.05，表 1、圖 1）。

3 討論

MMP是一類鋅原子依賴性內(nèi)切酶，MMP-9是MMP家族的重要一員。AQP4是一種與水通透相關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)腦組織的水轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。Rosenberg等[4]發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)注入MMP-9后，腦部毛細(xì)血管通透性增加。Hamann等[5]報(bào)道活化的MMP9通過(guò)分解層粘連蛋白、膠原酶，并破壞緊密連接蛋白來(lái)促進(jìn)炎性浸潤(rùn)，改變血腦屏障的通透性形成腦水腫。Manley等[6]在敲除AQP4基因的小鼠上進(jìn)行水中毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，敲除AQP4基因后的大鼠腦內(nèi)水容量及星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍毛細(xì)血管水腫明顯減輕，成活能力高于對(duì)照組。研究表明，MMP-9能水解細(xì)胞外基質(zhì)所含膠原成分和層粘蛋白及纖維蛋白，促進(jìn)基底膜的降解，使其完整性遭到破壞，血腦屏障通透性增加，促進(jìn)腦水腫的形成。腦出血引起的細(xì)胞內(nèi)外水和電解質(zhì)失衡、滲透壓的改變，可激活位于細(xì)胞膜上的AQP4，進(jìn)而促進(jìn)水和電解質(zhì)通過(guò)AQP4進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而導(dǎo)致細(xì)胞水腫。Higashida等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抑制AQP4表達(dá)，可降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫的程度。王紅祥等[8]發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可通過(guò)降低腦缺血損傷大鼠再灌注損傷腦組織MMP9的表達(dá)及含水量而發(fā)揮腦保護(hù)作用。因此，針對(duì)調(diào)控MMP9、AQP4的藥物或其他手段將可能成為治療腦水腫的新方法。

表 1 2 組 MMP-9、AQP4 的 IOD 值比較（x±s）

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周圍組織中MMP-9（A-F）及AQP4（G-L）表達(dá)（DAB染色，×400）

對(duì)腦水腫的治療，西醫(yī)主要使用以甘露醇為代表的滲透性脫水劑，在急性期，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，多伴有電解質(zhì)紊亂、腎功能不全、心律失常等并發(fā)癥，而甘露醇可誘發(fā)和加重上述并發(fā)癥，在多次使用后，腦組織中的甘露醇濃度可大于治療時(shí)血中的濃度，使脫水作用喪失，療效減低[9]。腦出血急性期中醫(yī)辯證多為痰熱腑實(shí)型，治療主要采用通腑化痰，清熱解毒之法。雙黃通腑顆粒中主用生大黃，旨在加強(qiáng)通腑泄熱的作用，配以人工牛黃，涼肝、豁痰、開(kāi)竅、息風(fēng)、解毒等，輔以水牛角，使得腑氣通后加強(qiáng)解毒、醒神、開(kāi)竅的功效。大黃能開(kāi)郁結(jié)，平血逆，止血上溢，上閉下奪，力可專主。三藥配伍，真正體現(xiàn)對(duì)中風(fēng)病急性期“通腑—泄毒—醒腦—開(kāi)竅”的基本發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦出血損傷后腦含水量增高，MMP-9、AQP4表達(dá)增加，以出血后第3天最高，隨后下降，第8天仍高于正常。藥物灌胃組大鼠在3、5、8 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，腦含水量、MMP9、AQP4的表達(dá)均低于鹽水對(duì)照組，這顯示雙黃通腑顆粒對(duì)大鼠腦出血后腦水腫良好的治療作用，可進(jìn)一步研究這種治療作用是否與其對(duì)腦出血時(shí)MMP9、AQP4的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

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E ffects of Shuanghuang Tongfu Grains on Brain Edem a of Rats after Intracerebral HeMorrhage

AN Bin,KANG Xu-hui,JIANG Yun-chao,CAofeng,HUANG Xian-gou,ZHANG Wei-dong,HU Wei,XIA Min,CHENGuo-hua.TraditionalChineseMedicalHospitalofYunmeng,Hubei432500,China

Objective:To study the effectof Shuanghuang Tongfu grains on thewater contentand the expression ofmatrix metalloproteinase-9(MMP9),aquaporin4(AQP4)in the brain of rats with intracerebral hemorrhage.Methods:Sixty SD ratswere random ly divided into gastric perfusion group and control group equally.Cerebral hemorrhagemodelsweremade by autologous blood injection.The gastric perfusion group was adm inistrated the Shuanghuang Tongfu grains liquor from the 2nd day,and the controlgroup

the equivalentnormal saline.Ten rats in 2 groupswere executed at the 3th,5th,8th day respectively.Thebrainwater contentwasmeasured,and the expression of MMP9,AQP4 around the hematoma area were observed by immunohistochemical method.Results:Compared with controlgroup,the brain water contentand the expression of MMP9,AQP4 of the gastric perfusion group decreased significantly (P＜0.05).Conclusion:Shuanghuang Tongfu grains can reduce the edema of brain as well as the protein levels of MMP9,AQP4 in rats with intracerebral hemorrhage,which shows therapeutic effectson ratbrain edema after intracerebralhemorrhage.

Shuanghuang Tongfu grains;cerebralhemorrhage;matrixmetalloproteinase-9;aquaporin4

R741;R741.05;R743.34

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.008

1.湖北省云夢(mèng)中醫(yī)院湖北 云夢(mèng)432500

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢430022

2014-02 -10

安斌

anbin1682007@163.com

（本文編輯：王晶）