外源性神經(jīng)生長因子治療大鼠腦出血的療效分析

倪厚杰，劉娜，李新華，唐洲平

外源性神經(jīng)生長因子治療大鼠腦出血的療效分析

倪厚杰1,2a，劉娜1，李新華2b，唐洲平1

目的：觀察外源性神經(jīng)生長因子（NGF）治療大鼠腦出血的療效。方法：48只SD大鼠隨機(jī)分成NGF組24只、腦出血組12只和假手術(shù)組12只。Ⅶ型膠原酶尾狀核注射制備大鼠腦出血模型；NGF組給予NGF血腫內(nèi)注射，腦出血組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組只進(jìn)針。分別于術(shù)后1、3及7 d對3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，免疫組化法檢測血腫灶周Nestin及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：造模后 7 d，NGF組神經(jīng)功能缺損評分降低，低于NGF組1 d及3 d時的評分（P＜0.05），且低于腦出血組7 d時的評分（P＜0.05）。各時間點(diǎn)NGF組Nestin及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），高于腦出血組（P＜0.05）；NGF組7 d時Nestin及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)高于同組1 d及3 d時（P＜0.05）。結(jié)論：外源性NGF有助于促進(jìn)腦出血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與激活腦出血大鼠的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞及促進(jìn)腦組織分泌VEGF有關(guān)。

腦出血；神經(jīng)功能缺損；免疫組織化學(xué)；神經(jīng)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）是主要由神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織或膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的活性蛋白質(zhì)[1]。研究表明，NGF在腦出血的神經(jīng)功能恢復(fù)和重建過程中有積極的促進(jìn)作用[2]，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究將外源性NGF立體定向?qū)氪笫笪矚ず搜[灶，觀察其對腦出血后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)、血腫灶周神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）激活及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）分泌的影響，探討外源性NGF治療大鼠腦出血的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量300～400 g，月齡3～4月，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK（鄂）2008-0005。

1.1.2 主要試劑與儀器 Ⅶ型膠原酶購于美國Sigma公司；NGF注射液（商品名：蘇肽生）由舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司提供；VEGF小鼠抗大鼠單克隆抗體和Nestin（NSCs標(biāo)志物）小鼠抗大鼠單克隆抗體均購于英國Abcam公司；山羊抗小鼠辣根過氧化物酶二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Narishige大鼠腦立體定位儀（日本）、5μL微量進(jìn)樣器（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）、LEICA CM 1900冰凍切片機(jī)（德國）、BX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）均由同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組12只、腦出血組12只、NGF組24只。腦出血組和NGF組均以Ⅶ型膠原酶尾狀核注射制備大鼠腦出血模型（前囟前0.5mm，向右旁開3.0mm，進(jìn)針深度5.5mm）；假手術(shù)組只進(jìn)針，不做腦出血模型。造模后30min，NGF組經(jīng)鉆孔緩慢注入2μL混有300 U NGF的生理鹽水，腦出血組給予2μL無菌生理鹽水，假手術(shù)組只進(jìn)針，不給予NGF或生理鹽水。

1.2.2 指標(biāo)檢測 分別于術(shù)后1、3及7 d進(jìn)行指標(biāo)觀察。按Zea Long 5分制（0～4分）對大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分。按隨機(jī)原則，抽取大鼠常規(guī)法制作腦組織石蠟切片，其中假手術(shù)組3只，腦出血組3只，NGF組6只；免疫組化法檢測Nestin及VEGF陽性表達(dá)，于400倍光鏡下觀察并隨機(jī)計數(shù)不同腦區(qū)5個不重復(fù)視野的Nestin及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)，計算其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分比較結(jié)果

NGF組及腦出血組大鼠術(shù)后1 d時癥狀體征比較明顯，3 d時神經(jīng)功能缺損評分最高，2組間及組內(nèi)神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后7 d，NGF組神經(jīng)功能缺損評分降低，低于NGF組1、3 d時的評分（P＜0.05），且低于腦出血組7 d時的評分（P＜0.05）。假手術(shù)組所有大鼠麻醉清醒后，均無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，見表1。

2.2 Nestin及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)比較

術(shù) 后 1、3、7 d，NGF 組 Nestin 及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），均高于腦出血組（P＜0.05）；NGF組7 d時Nestin及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)高于同組 1、3 d時（P＜0.05），見表 2。

3 討論

成年哺乳動物顱內(nèi)存在NSCs[3]，具有自我更新、向腦組織受損處遷移、分化成多種腦細(xì)胞的潛能等特性[4]。在生理狀態(tài)下處于靜息，在卒中或神經(jīng)遞質(zhì)刺激后，靜息狀態(tài)下的NSCs被激活[5]。NGF可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs遷移、分化及增殖。孫劍瑞等[6]觀察不同濃度的NGF對體外培養(yǎng)NSCs的影響，證實(shí)NGF在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)NSCs增殖。施英唐等[7]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NGF對NSCs有明顯的定向趨化吸引功效，與濃度正相關(guān)。這可能是由于NSCs細(xì)胞體表面有TrkA和P75受體，其中TrkA受體與NGF有高度親和性[8]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使NSCs增殖產(chǎn)生的新神經(jīng)前體細(xì)胞向NGF濃度高的區(qū)域遷移，最終到達(dá)神經(jīng)受損區(qū)域。烏優(yōu)圖等[9]證實(shí)使用NGF治療的腦出血大鼠與對照組相比，單個神經(jīng)元的平均軸突數(shù)量和最長軸突平均長度均顯著增加，說明NGF有促進(jìn)神經(jīng)元軸突芽生、分枝和生長的功能[10]，在NSCs向神經(jīng)元分化過程中，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長錐的數(shù)目增加，最終神經(jīng)元突起數(shù)量增加。周政等[11]在大鼠流體腦創(chuàng)傷模型中，觀察到NGF處理可使大鼠腦組織中Nestin陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。本研究向大鼠腦出血模型病灶內(nèi)直接注入外源性NGF，結(jié)果顯示NGF組大鼠腦出血灶周Nestin的陽性細(xì)胞數(shù)較腦出血組及假手術(shù)組明顯增多，提示外源性NGF具有激活內(nèi)源性NSCs，并促進(jìn)其增殖的作用。推測其作用機(jī)制可能與NGF受體（TrkA及P75）的介導(dǎo)有關(guān)[12]。

VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，有很強(qiáng)的血管生成作用[13]。VEGF的靶細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞，可促進(jìn)其增殖，令血管通透性增加，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的增加血管通透性的物質(zhì)之一[14]。在成年哺乳動物神經(jīng)組織中，神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)VEGF[15]，但正常情況下腦組織中VEGF幾乎不表達(dá)，只有當(dāng)腦組織嚴(yán)重受損或外源性NGF刺激下才表達(dá)增多。人體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分布著一定數(shù)量的VEGF受體。VEGF作為一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素與受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，啟動下游細(xì)胞信號級聯(lián)，特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其分裂增殖，最終形成新生血管[16]。研究發(fā)現(xiàn)NGF通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)可間接促進(jìn)血管形成，NGF也能直接促進(jìn)血管形成[17]。Park等[18]發(fā)現(xiàn)NGF在基質(zhì)膠上可促進(jìn)新血管形成，當(dāng)敲除小鼠的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMP）-2 后，這種作用則無法顯現(xiàn)，提示NGF可能通過MMP-2的作用刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，經(jīng)PI3K/TrkA信號通路和AP-2轉(zhuǎn)錄因子[19]，促進(jìn)新生血管生成。周宏等[20]研究顯示外源性NGF可促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦內(nèi)的VEGF表達(dá)上調(diào)，腦內(nèi)新生毛細(xì)血管明顯增多。Calza等[21]在研究NGF對新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)的作用時發(fā)現(xiàn)，NGF首先促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并通過趨化作用使增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至頸上神經(jīng)節(jié)周圍，最終促進(jìn)新生血管形成，提示NGF是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來實(shí)現(xiàn)新生血管形成。也有研究顯示，NGF能使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+向細(xì)胞外釋放，從而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞緊張性，降低神經(jīng)細(xì)胞興奮性，使神經(jīng)支配的血管擴(kuò)張，血流量增加，新生血管形成，說明NGF調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)外Ca2+的分布是促進(jìn)新血管形成的機(jī)制之一[22]。

表 1 3組 Zea Long評分比較（分，x±s）

表2 3組Nestin及VEGF陽性細(xì)胞計數(shù)比較（個,x±s）

在正常狀況下，機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的NGF非常少，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時，內(nèi)源性NGF的表達(dá)會短暫微量增加，但仍不足以激活內(nèi)源性NSCs和促進(jìn)更多的VEGF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NGF組術(shù)后7 d，神經(jīng)功能恢復(fù)好，灶周腦組織中Nestin及VEGF陽性細(xì)胞較腦出血組和假手術(shù)組明顯增多，提示NGF促進(jìn)腦出血大鼠的腦組織新生神經(jīng)元和新生血管形成，達(dá)到神經(jīng)修復(fù)和重建的效果，這與上述國內(nèi)外多個研究結(jié)論相符。本實(shí)驗(yàn)存在的不足是樣本量和觀察時間點(diǎn)偏少。因此，NGF對腦出血的修復(fù)作用機(jī)制還有待更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來證實(shí)。

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Effect of Exogenous Nerve Growth Factor Treatment on Rats with In tracereb ral Hemorrhage

NIHou-jie,LIU Na,LIXin-hua,TANG Zhou-ping.Department ofNeurology,TongjiHospital,TongjiMedical College,Huazhong University ofScience and Technololy,Wuhan 430030,China

Objective:To observe the therapeutic effect of exogenous nerve growth factor(NGF)on rats after intracerebralhemorrhage(ICH).Methods:Forty-eightSD ratswere random ly divided into NGFgroup(n=24),ICH group(n=12)and sham group(n=12).ICHmodelsweremade by injectingⅦcollagenase into caudate nucleus of rats.Rats in NGFgroup were treated with NGFwhereas those in ICH group

normalsaline.The neurological function wasevaluated,and the Nestin and vascular endothelialgrowth factor(VEGF)positive cells located perihematoma were detected by immunohistochem istry at 1,3 and 7 days after operation respectively.Results:The neurologicalseverity score at7 d afteroperation was lower than those at1 and 3 days afteroperation in NGF group (P＜0.05).The neurological severity score of NGF group was lower than thatof ICH group at7 days after operation(P＜0.05).Thenumbersof VEGFand Nestin positive cells in NGFgroupwere significantly higher than those in sham group (P＜0.01)and those in ICH group (P＜0.05)at1,3,7 days after operation.The numbers of VEGFand Nestin positive cellsat7 daysafter operation wasgreater than those at1 and 3 daysafter operation in NGFgroup(P＜0.05).Conclusion:Exogenous NGF contributes to the improvementof neural function recovery of rats after ICH,which may be mediated by activation of endogenous neural stem cells and increase of VEGF expression.

intracerebral hemorrhage；neurologic impairment；immunohistochem istry；neural stem cells；vascularendothelialgrowth factor

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.005

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 武漢430030

2.武漢市第一醫(yī)院a.神經(jīng)內(nèi)科，b.體檢中心 武漢430022

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81171089）湖北省衛(wèi)生廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目（No.JX4A 03）

2014-06 -15

唐洲平

ddjtzp@163.com

（本文編輯：王晶）