MRS2179對大鼠缺血性腦卒中后MMP-9表達(dá)及血腦屏障通透性的影響

張秋佳，楊錦珊，劉陽，王偉

MRS2179對大鼠缺血性腦卒中后MMP-9表達(dá)及血腦屏障通透性的影響

張秋佳，楊錦珊，劉陽，王偉

目的：觀察P2Y1受體抑制劑MRS2179對大鼠缺血性腦卒中后MMP-9表達(dá)及血腦屏障（BBB）通透性的影響。方法：45只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、MRS2179組各15只。假手術(shù)組及模型組經(jīng)側(cè)腦室注射5μL人工腦脊液（aCSF），MRS2179組側(cè)腦室注射5μLMRS2179（2 nmol）。制備大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，假手術(shù)組不予缺血。缺血再灌注24 h后，應(yīng)用干濕重法檢測腦組織含水量；伊文思藍(lán)染料（EB）溢出量定量檢測BBB通透性改變；Western blot法檢測MMP-9蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組、假手術(shù)組、MRS2179組的腦含水量分別為（81.72±0.23）%、（77.65±0.27）%、（79.92±0.24）%（n=6），模型組高于假手術(shù)組（P＜0.01）；MRS2179組較模型組有所下降（P＜0.01），但仍高于假手術(shù)組（P＜0.01）。模型組梗死側(cè)腦組織血管外 EB 溢出量為（1737.60±67.46）ng/g，顯著高于假手術(shù)組（324.18±63.35）ng/g（P＜0.01）；MRS2179 組梗死側(cè)腦組織血管外 EB 溢出量為（1165.15±93.26）ng/g，較模型組明顯下降（P＜0.01）（n=6）。假手術(shù)組、模型組、MRS2179再灌注24 h梗死邊緣區(qū)腦組織中相對MMP-9蛋白含量分別為（0.52±0.05）、（1.69±0.08）、（0.99±0.10）（n=3），模型組與假手術(shù)組相比明顯升高（P＜0.01），MRS2179 組與模型組比較顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論：P2Y1R抑制劑MRS2179可能通過降低MMP-9表達(dá)，降低BBB通透性，減輕缺血性腦卒中后腦水腫程度。

MRS2179；缺血性腦卒中；血腦屏障；腦水腫；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

wwang@tjh.tjmu.edu.cn

腦缺血時(shí)，大量三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate，ATP）從受損的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中釋放出來，通過作用于嘌呤受體家族而產(chǎn)生一系列效應(yīng)。P2Y1受體是一種G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]，近年來研究表明其在阿茨海默病、心肌缺血及冠狀動脈血流調(diào)節(jié)中發(fā)揮重大作用[2-4]；對于缺血性腦卒中，相關(guān)研究主要集中于P2Y1受體對星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖、相關(guān)營養(yǎng)因子釋放[5]，以及多種細(xì)胞因子、趨化因子的調(diào)節(jié)的影響[6]，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其對血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的作用。

BBB作為維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間緊密連接、毛細(xì)血管基底膜及嵌入其中的周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞足突及細(xì)胞外隙構(gòu)成。腦部缺血再灌注損傷時(shí)，BBB的破壞導(dǎo)致血管性腦水腫及一系列繼發(fā)性腦部損害，被認(rèn)為是大腦各項(xiàng)病理生理學(xué)改變的基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)指出，腦缺血時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9，MMP-9）能通過分解緊密連接蛋白而增加BBB通透性，從而在腦水腫的形成中具有重要作用[7]。

相關(guān)研究表明，大鼠在經(jīng)歷大腦中動脈阻塞（middle cerebralartery occlusion，MCAO）再灌注損傷后，缺血邊緣區(qū)組織P2Y1受體表達(dá)上調(diào)[6]，因此，本研究擬應(yīng)用 MRS2179（2′-Deoxy-N6-methyl adenosine3′,5′-diphosphate）特異性抑制P2Y1受體，觀察其對MCAO模型腦水腫及BBB破壞程度的影響，探討P2Y1受體在腦缺血性卒中中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量250～300 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 MRS2179購自美國Sigma-Aldrich公司，伊文思藍(lán)（E-vans Blue，EB）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，兔抗多克隆MMP-9抗體購自美國M illipore公司，兔抗β-actin多克隆抗體購自博士德生物有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG （H+L）、SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自美國 Thermo Scientific Pierce公司，Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)購自美國Syngene公司，BX51TR大鼠立體定位儀購自日本奧林巴斯公司，ZXRD-A5110鼓風(fēng)干燥箱購自上海智誠分析儀器有限公司，Sunrise全自動酶標(biāo)光度計(jì)購自瑞士天美公司，激光多普勒血流儀購自英國Moor instrument公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 45只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、MRS2179組各15只。

1.2.2 藥物干預(yù)及模型建立 ①側(cè)腦室藥物注射：將MRS2179溶于人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF），采用氯胺酮（75mg/kg）及甲苯噻嗪（20mg/kg）聯(lián)合腹腔麻醉，將大鼠固定于立體定位儀，暴露顱骨，于前囟旁1.4mm，向后1.0mm處利用錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜，MRS2179組用5μL微量加樣器由孔內(nèi)深入4.0 mm緩慢注入5μL MRS2179（2 nmol）[6]，假手術(shù)組及模型組僅注射5μL aCSF，留針15min后緩慢拔除微量加樣器，縫皮，消毒。②MCAO模型建立：采用線栓法[8]，取側(cè)腦室注射15m in后大鼠，仰臥位固定，頸正中切口暴露頸部，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈，在頸總動脈分叉處稍下方小心插入栓子（直徑為0.23mm的魚線，表面包裹牙膠），栓子尖端到達(dá)頸內(nèi)動脈及遠(yuǎn)端以阻斷大腦中動脈血供，缺血1 h后拔出栓子恢復(fù)血液灌流，術(shù)中維持大鼠肛溫（36.6±0.5）℃；假手術(shù)組只分離、暴露血管，不予缺血處理。術(shù)中運(yùn)用激光多普勒血流儀監(jiān)測大鼠局部腦血流；術(shù)后取腦過程中發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血證據(jù)的大鼠不納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腦組織含水量測定 大鼠缺血1 h，再灌注24 h，腹腔麻醉后急性斷頭取腦，取梗死側(cè)半球腦組織稱重，立即放入烤箱（100℃）24 h后取出再次稱重。腦組織含水量的具體計(jì)算方法為（濕重-干重）/濕重×100%（n=6）。

1.2.4 BBB通透性定量測定 大鼠缺血1 h，再灌注24 h，腹腔麻醉后通過大鼠左側(cè)股靜脈將2%EB生理鹽水溶液（4m L/kg）緩慢注入。1 h后，仰臥位固定大鼠，迅速開胸暴露心臟，左心室行肝素化生理鹽水沖洗，直至右心房流出液變?yōu)槌吻鍟r(shí)停止，以去除血管內(nèi)的EB染料。迅速斷頭取腦，將梗死側(cè)與非梗死側(cè)半球分開后稱重記錄。選用三氯乙酸法定量測定腦組織中殘余EB含量，將梗死側(cè)半球放入50%三氯乙酸溶液中充分研磨，研磨液12 000 g高速離心20min，取上清與無水乙醇按1∶3稀釋后利用全自動酶標(biāo)儀（激發(fā)波長620 nm，發(fā)射波長680 nm）測量光密度值，計(jì)算每克腦組織中所含溢出EB染料含量。

1.2.5 Western Blot檢測 將缺血再灌24 h的3組大鼠各3只麻醉后斷頭取腦，冰面上快速分離梗死側(cè)皮質(zhì)缺血邊緣區(qū)腦組織，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入一抗 MMP9（1∶1 000），β-actin（1∶800），4 ℃搖床過夜，TBST 漂洗4次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗4次，運(yùn)用超敏ECL發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測MMP9、β-actin的蛋白表達(dá)水平，利用凝膠成像儀拍攝照片，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，并利用Image J軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量測定

模型組、假手術(shù)組、MRS2179組的腦含水量分別為（81.72±0.23）%、（77.65±0.27）%、（79.92±0.24）%（n=6），模型組高于假手術(shù)組，有顯著性差異（P＜0.01）；MRS2179 組較模型組下降（P＜0.01），但仍高于假手術(shù)組（P＜0.01）（圖 1）。這表明，MRS2179能減輕大鼠缺血性腦卒中后腦水腫程度。

2.2 BBB通透性測定

模型組梗死側(cè)腦組織血管外EB溢出量為（1737.60±67.46）ng/g，顯著高于假手 術(shù) 組 （324.18 ±63.35）ng/g（P＜0.01）。MRS2179組梗死側(cè)腦組織血管外EB溢出量為（1165.15±93.26）ng/g，較模型組明顯下降（P＜0.01）（n=6）（圖 2）。這表明，注射MRS2179的大鼠在腦缺血再灌注損傷后，BBB通透性下降，BBB完整性較模型組更好。

2.3 Western Blot檢測MMP-9蛋白表達(dá)

假手術(shù)組、模型組、MRS2179組再灌注24 h梗死邊緣區(qū)腦組織中MMP-9蛋白含量分別為（0.52±0.05）、（1.69±0.08）、（0.99±0.10）（n=3），模型組與假手術(shù)組相比明顯升高（P＜0.01），MRS2179 組與模型組比較顯著下降（P＜0.01）（圖 3）。

3 討論

腦卒中在我國已經(jīng)成為最常見的致殘及死亡原因，其中又以缺血性腦卒中為主。BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，因此BBB的破壞以及功能失調(diào)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷中起重要作用。本研究結(jié)果表明，缺血1 h，再灌注24 h后，模型組梗死側(cè)腦組織BBB通透性及腦組織含水量較假手術(shù)組腦組織明顯上升，MRS2179組同樣損傷后缺血側(cè)腦組織BBB通透性及腦組織含水量較模型組明顯下降。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallo proteinases，MMPs）是一組金屬離子依賴的蛋白酶家族，其中，MMP-9由內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌并在缺血性腦卒中的大鼠模型及卒中患者中表達(dá)上調(diào)[9,10]。MMP-9能降解腦血管基底膜、層粘連蛋白、Ⅳ～Ⅴ型膠原蛋白等BBB的關(guān)鍵組成部分，從而導(dǎo)致BBB通透性的改變及血管性腦水腫的形成。有實(shí)驗(yàn)證明MMP-9基因敲除鼠在局灶性腦缺血過程中能保持BBB的相對完整[11,12]，類似的研究結(jié)果也出現(xiàn)在使用化學(xué)藥物抑制MMP的實(shí)驗(yàn)中[13]。本研究結(jié)果表明，P2Y1R的選擇性抑制劑MRS2179可改善腦缺血時(shí)BBB功能，且與MMP-9的表達(dá)下調(diào)具有一定的相關(guān)性。

此前已有研究發(fā)現(xiàn)，ATP可通過激活另一種嘌呤受體P2X7導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞分泌MMP-9增多[14]，因此筆者認(rèn)為，P2Y1R 作為一種在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布表達(dá)的重要嘌呤受體，同樣參與調(diào)節(jié)MMP-9的分泌與表達(dá)，從而在生理及病理?xiàng)l件下對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重要的影響。

MMPs在腦缺血性卒中中的另一個(gè)重要的病理生理作用與神經(jīng)元失巢凋亡有關(guān)，相關(guān)研究表明卒中發(fā)生后，MMPs通過降解腦實(shí)質(zhì)中腦細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接，特別是通過降解神經(jīng)元周圍的基質(zhì)蛋白而導(dǎo)致神經(jīng)元的失巢凋亡[15]。同時(shí)，已有研究證實(shí)P2Y1受體能介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]。結(jié)合本研究結(jié)果筆者推測，抑制P2Y1受體而起到的抗凋亡作用部分可能通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

圖1 3組大鼠腦組織含水量（A）及EB溢出量（B）比較

圖3 3組大鼠MMP-9蛋白電泳（A）及表達(dá)比較（B）

MRS2179抑制由缺血而導(dǎo)致的MMP-9上調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)導(dǎo)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMPs） 是一組被公認(rèn)的MMPs內(nèi)源性抑制劑，TIMP-1通常情況下會與MMP-9以1∶1的比例形成復(fù)合物[17]，在生理及病理?xiàng)l件下通過高親和性非共價(jià)鍵與MMP-9的催化區(qū)結(jié)合，下調(diào)MMP-9的表達(dá)與活性[18,19]。TIMPs/MMPs之間的動態(tài)平衡對于維持BBB的正常功能具有重要作用，因此，MRS2179可能通過上調(diào)基質(zhì)中的TIMP-1含量而降低MMP-9的表達(dá)與活性，從而降低腦缺血時(shí)升高的BBB通透性。另一個(gè)可能的機(jī)制是P2Y1R抑制劑MRS2179抑制PI3-K/Akt-NF-kappaB通路，而MMP-9的表達(dá)與NF-kappaB通路緊密相關(guān)[20]，因此使得MMP-9的表達(dá)降低。為了明確各種可能的機(jī)制，仍需進(jìn)行一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，升高的MMP-9表達(dá)與腦缺血性卒中后BBB的通透性增高與繼發(fā)性腦水腫密切相關(guān)，MRS2179可能通過下調(diào)缺血梗死邊緣區(qū)腦組織中MMP-9的表達(dá)，達(dá)到改善BBB整體功能，減輕腦水腫的目的，這為治療缺血性腦血管病提供了新的靶點(diǎn)。

[1]Franke H,Illes P.Involvement of P2 receptors in the growth and survival of neurons in the CNS[J].Pharmacol Ther,2006,109:297-324.

[2]Moore D,Iritani S,Chambers J,et al.Immunohistochemical localization of the P2Y1 purinergic receptor in A lzheimer's disease[J].Neuroreport,2000,11:3799-3803.

[3]Olivecrona GK,G?tberg M,Harnek J,et al.The ADP receptor P2Y(1)mediates t-PA release in pigs during cardiac ischemia[J].J Thromb Thrombolysis,2007,24:115-122.

[4]Bender SB,Berwick ZC,Laughlin MH,etal.Functional contribution of P2Y1 receptors to the control of coronary blood flow [J].J Appl Physiol,2011,111:1744-1750.

[5]Sun JJ,Liu Y,Ye ZR.Effectsof P2Y1 receptor on glial fibrillary acidic protein and glial cell line-derived neurotrophic factorproduction ofastrocytesunder ischemic condition and the related signaling pathways[J].Neurosci Bull,2008,24:231-243.

[6]Kuboyama K,Harada H,Tozaki-Saitoh H,et al.Astrocytic P2Y(1)receptor is involved in the regulation of cytokine/chemokine transcription and cerebraldamage in a ratmodelof cerebral ischemia[J].JCereb Blood Flow Metab,2011,31:1930-1941.

[7]Yang Y,Rosenberg GA.MMP-mediated disruption of claudin-5 in the blood-brain barrier of ratbrain after cerebral ischemia[J].MethodsMol Biol,2011,762:333-345.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91.

[9]Rosenberg GA,Estrada EY,Dencoff JE.Matrixmetalloproteinasesand TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in ratbrain[J].Stroke,1998,29:2189-2195.

[10]Horstmann S,Kalb P,Koziol J,et al.Profiles of matrix metalloproteinases,their inhibitors,and laminin in stroke patients:influence of different therapies [J].Stroke,2003,34:2165-2170.

[11]AsahiM,Asahi K,Jung JC,et al.Role for matrixmetalloproteinase9 after focal cerebral ischem ia:effectsof gene knockoutand enzyme inhibition with BB-94[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20:1681-1689.

[12]AsahiM,Wang X,Mori T,etal.Effectsof matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia[J].J Neurosci,2001,21:7724-7732.

[13]Romanic AM,White RF,Arleth AJ,et al.Matrixmetalloproteinase expression increasesafter cerebral focal ischem ia in rats:inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size[J].Stroke,1998,29:1020-1030.

[14]Murphy N,Lynch MA.Activation of the P2X(7)receptor inducesm igration of glial cells by inducing cathepsin B degradation of tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1[J].JNeurochem,2012,123:761-770.

[15]Gu Z,KaulM,Yan B,et al.S-nitrosylation of matrix metalloproteinases:signaling pathway to neuronal cell death[J].Science,2002,297:1186-1190.

[16]Sellers LA,Simon J,Lundahl TS,et al.Adenosine nucleotidesacting at the human P2Y1 receptor stimulate Mitogen-activated protein kinases and induce apoptosis[J].J Biol Chem,2001,276:16379-16390.

[17]Crocker SJ,Pagenstecher A,Campbell IL.The TIMPs tango with MMPs and more in the centralnervoussystem[J].JNeurosciRes,2004,75:1-11.

[18]Cunningham LA,Wetzel M,Rosenberg GA.Multiple roles forMMPsand TIMPs in cerebral ischemia[J].Glia,2005,50:329-339.

[19]HornebeckW,LambertE,Petitfrère E,etal.Beneficialand detrimental influencesof tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1(TIMP-1)in tumor progression[J].Biochim ie,2005,87:377-383.

[20]Wu CY,Hsieh HL,Jou MJ,et al.Involvement of p42/p44 MAPK,p38 MAPK,JNK and nuclear factor-kappa B in interleukin-1beta-induced matrix metalloproteinase-9 expression in rat brain astrocytes[J].JNeurochem,2004,90:1477-1488.

M RS2179 Reduces the MM P-9 Exp ression and Blood-brain Barrier Perm eability in Rat Brain

after Focal Cerebral Ischem ia

ZHANG Qiu-jia,YANG Jin-shan,LIU Yang,WANGWei.Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To observe the effects of selective P2Y1R antagonist,MRS2179,on the expression of MMP-9 and the blood-brain barrier(BBB)permeability in a ratmodelofm iddle cerebralartery occlusion(MCAO).Methods:All45 SD ratswere random ized into 3 groups:sham group(n=15),modelgroup(n=15)and MRS2179 group(n=15).Intracerebroventricularadm inistration of 5μL vehicle control(aCSF)was performed to the sham group and themodelgroup.Meanwhile,5μL ofMRS2179(2 nmol)wasgiven to the rats in theMRS2179 group in the sameway.TheMCAOmodelsweremade in the groups controland MRS2179.The sham group was treated in the samemanner as those undergoing MCAO,however,no occluding thread was inserted.A fter 24 h reperfusion,thewet/drymethod wasused to evaluate the brain water contentof the ischemic hem isphere,the Evans Blue dye(EB)extravasation wasmeasured to assess the BBB permeability and the expression of MMP-9 was determ ined by Western blot.Results:The brain water content in themodel group,the sham group and the MRS2179 groupwas(81.72±0.23)%,(77.65±0.27)%,(79.92±0.24)%respectively(n=6).Compared with themodelgroup,the brainwater content in theMRS2179 groupwasdecreased,butwasstillhigher than thatin the sham group(P＜0.01).The EB extravasation from the ischemic hem isphere in themodel group was(1737.60±67.46)ng/g,remarkably higher than those in the in theMRS2179 group[(1165.15±93.26)ng/g]and sham group[(324.18±63.35)ng/g](P＜0.01)(n=6).In terms of the expression ofMMP-9 in the ischemic penumbra,the protein amountwas(0.52±0.05),(1.69±0.08)and(0.99±0.10)respectively in the sham group,themodelgroup and theMRS2179 group(n=3).The protein amountin theMRS2179 groupwassignificantly lower than thatin themodelgroup(P＜0.01).Conclusion:Inhibition of P2Y1R by MRS2179m ight reduce the BBB permeability and relieve brain edema after the ischemic cerebralstroke by decreasing theexpression ofMMP-9.

MRS2179;ischemic cerebralstroke;blood-brain barrier;brain edema;matrixmetalloproteinase-9

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.003

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 武漢430030

國家自然科學(xué)基金（No.81030021）

2013-08 -02

王偉

（本文編輯：王晶）