線粒體分裂蛋白抑制劑對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡的作用及機制

謝南昌 ，陳晨 ，王翠 ，張倩 ，張宏偉 ，夏建華 ，連亞軍

線粒體分裂蛋白抑制劑對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡的作用及機制

謝南昌1a，陳晨1a，王翠1b，張倩1a，張宏偉2，夏建華3，連亞軍1a

目的：研究線粒體分裂蛋白抑制劑對β淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡的作用及其機制。方法：隨機將BV-2小膠質(zhì)細胞分為con組、Aβ組、mdi組和Aβ+mdi組，con組不做特殊處理，mdi組培養(yǎng)基中加入 10μmol/Lmdivi-1，Aβ 組培養(yǎng)基中加入 20 μmol/L Aβ，Aβ+mdi組培養(yǎng)基分別加入 2、5、10、20 μmol/L mdivi-1和20μmol/L Aβ。采用MTT法檢測細胞存活率，TUNEL染色檢測細胞凋亡，Western blot法檢測Drp1、CytC和Caspase-3蛋白水平變化，RT-PCR法檢測CA11bmRNA表達變化。結(jié)果：與con組相比，Aβ組的細胞存活率明顯下降，凋亡顯著增加，CA11bmRNA上升，線粒體Drp1、細胞漿CytC和激活的 Caspase-3增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Aβ組相比，Aβ+mdi組的細胞存活率明顯上升，凋亡顯著減少，CA11bmRNA下降，線粒體Drp1、細胞漿CytC和激活的Caspase-3減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：線粒體分裂蛋白抑制劑對Aβ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡有保護作用，其機制可能為抑制線粒體/CytC/Caspase-3凋亡途徑。

β淀粉樣蛋白；小膠質(zhì)細胞；線粒體；線粒體分裂蛋白抑制劑

阿爾茨海默?。ˋ lzheimer disease,AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)生于中老年患者。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的生成和清除失衡，導(dǎo)致Aβ在腦實質(zhì)內(nèi)沉積，形成AD主要病理學改變老年斑，是AD發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)[1]。Aβ一方面直接與神經(jīng)元表面分子相互作用誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，另一方面通過激活膠質(zhì)細胞引起腦內(nèi)免疫炎癥間接引起神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細胞是AD腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞，具有支持、營養(yǎng)、保護和修復(fù)神經(jīng)細胞等作用，過度激活或凋亡后分泌多種炎癥細胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)作用于相應(yīng)的受體，引起周圍細胞炎癥及死亡[2,3]。

線粒體是高度動態(tài)的細胞器，在細胞內(nèi)發(fā)生頻繁的融合與分裂。動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）是線粒體分裂調(diào)控關(guān)鍵蛋白，主要位于細胞質(zhì)，受線粒體外膜分子Fis1的招募而轉(zhuǎn)位至線粒體潛在分裂位點形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，逐漸壓縮直至線粒體斷裂。線粒體分裂后，Drp1重新回到細胞質(zhì)，如此循環(huán)反復(fù)[4]。線粒體分裂蛋白抑制劑（mitochondrialdivision inhibitor，Mdivi-1）是一種喹唑酮類衍生物，通過抑制GTP酶的活性來抑制Drp1功能[5]。已有文獻報道Mdivi-1可以減輕谷氨酸引起的神經(jīng)損傷和缺血性腦損傷[6]。但線粒體分裂在Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞凋亡過程中是否發(fā)揮作用及具體機制尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 BV-2小膠質(zhì)細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（購自美國Gibco公司）；MTT（購自美國Sigma-A ldrich公司）；TUNEL試劑盒（購自瑞士 Roche公司）；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（購自美國 Beckman Coulter公 司）；QIAGEN RNeasy M inikit（購自美國Invitrogen公司）；Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TAKARA公司）；全蛋白提取試劑盒，細胞質(zhì)和線粒體蛋白提取試劑盒及細胞核和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（購自南京建成生物有限公司)；一抗：Drp1、CytC（購自美國Santa Cruz公司），Caspase-3（購自美國CellSignaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 BV-2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及處理BV-2細胞37℃水浴后離心去除凍存液，移至含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BV-2細胞隨機分為4組：con組、Aβ 組、mdi組和 Aβ+mdi組。mdi組培養(yǎng)基中加入 mdivi-1（10 μmol/L），孵育24 h；Aβ 組 培 養(yǎng) 基 中 加 入 Aβ（20μmol/L），孵育 24 h；Aβ+mdi組又分為4個亞組，在加入20μmol/L的Aβ之前 1 h先加入10μmol/L的mdivi-1并孵育24 h，4個亞組的mdivi-1的終濃度分別為 2、5、10 和 20 μmol/L，con組不做特殊處理。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 按1×104/孔的密度將細胞接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入20μLMTT，然后將培養(yǎng)板置于37℃孵育4 h，最后使用ELISA讀數(shù)儀在570 nm波長下檢測比色度。

1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 將細胞按1×105/孔的密度種植于鋪有載玻片的12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱孵育后取出載玻片，用丙酮/甲醇（1∶1)室溫固定5m in，按TUNEL試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 RT-PCR檢測 按QIAGEN RNeasy M inikit說明書操作抽提RNA，紫外分光光度儀測量RNA濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。CD11b：正義鏈：5'-GATGCTTACCTGGGTTATGCTTCT-3'，反義鏈：5'-CCGAGGTGCTCCTAAAACCA-3'，由生工生物工程股份有限公司合成。94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 3 m in，60℃退火45 s，72℃延伸 1m in，40個循環(huán)，再72℃延伸3m in。2%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠分析系統(tǒng)分析，結(jié)果以光密度（opticaldensity，OD）值表示，以 β-actin作為內(nèi)參。以電泳圖中各組CD11b分別與β-actin的OD比值作為目的基因相對表達水平，計算出相對系數(shù)。

圖1 RT-PCR檢測4組CD11bmRNA水平及統(tǒng)計學分析

1.2.5 Western blot檢測 分別提取細胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定提取的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗用封閉液稀釋至適當濃度，加入后置于4℃冰箱反應(yīng)過夜。洗膜后加入封閉液稀釋至適當濃度的二抗室溫孵育1 h，ECL顯影、定影，并重復(fù)3次。采用Quantity one測定條帶光密度，以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參條帶OD比值作為目的蛋白的相對表達量。結(jié)果使用ID Image Analysis Software進行灰度測定，結(jié)果以O(shè)D值表示，以目的蛋白表達條帶的OD值分別與相應(yīng)的內(nèi)參OD比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量結(jié)果以（均數(shù)±標準差）（x±s）表示，單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）及Newman-Keuls檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組CD11bmRNA表達比較

RT-PCR結(jié)果顯示，與con組比較，Aβ組小膠質(zhì)細胞的CD11bmRNA表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Aβ組比較，Aβ+mdi組的小膠質(zhì)細胞中CD11bmRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 1。

2.2 3組小膠質(zhì)細胞存活率比較

MTT結(jié)果顯示，與con組比較，Aβ組的小膠質(zhì)細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Aβ組比較，Aβ+mdi組的小膠質(zhì)細胞存活率提高，且當mdivi-1濃度為10μmol/L時細胞存活率最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 3組小膠質(zhì)細胞凋亡比較

TUNEL染色顯示，與con組比較，Aβ組小膠質(zhì)細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與 Aβ 組比較，Aβ+mdi組的小膠質(zhì)細胞凋亡明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 3。

2.4 4組小膠質(zhì)細胞Drp1水平比較

Western blot顯示，與con組比較，Aβ組小膠質(zhì)細胞線粒體Drp1增加，細胞質(zhì)Drp1減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Aβ組比較，Aβ+mdi組的細胞線粒體Drp1水平明顯增加，細胞質(zhì)Drp1水平減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 4。

2.5 4組CytC釋放及Caspase-3激活比較

Western blot顯示，與con組比較，Aβ組促進線粒體釋放CytC進入細胞質(zhì)，并顯著激活Caspase-3，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與 Aβ 組比較，Aβ+mdi組線粒體CytC釋放進入細胞質(zhì)減少，且Caspase-3激活減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 5。

3 討論

研究證明，Aβ在AD的病理過程中具有重要作用，Aβ對小膠質(zhì)細胞有趨化作用，并激活小膠質(zhì)細胞，激活的小膠質(zhì)細胞一方面吞噬Aβ，另一方面又產(chǎn)生炎癥介質(zhì)引起局部損傷。本研究結(jié)果顯示Aβ孵育后小膠質(zhì)細胞CD11bmRNA明顯升高，細胞存活率明顯下降，凋亡亦顯著增加，證明Aβ可引起小膠質(zhì)細胞過度激活及凋亡，結(jié)果與以往文獻相似。已有研究證明在AD、亨廷頓?。℉untington's disease，HD）和帕金森病（Parkinson's disease，PD）等神經(jīng)變性病發(fā)病過程中均存在線粒體分裂明顯增強，線粒體動力學障礙進一步引起線粒體功能障礙[7-9]。線粒體動力學障礙可引起線粒體膜電位下降，并發(fā)生通透性轉(zhuǎn)運，使得CytC和AIF等促凋亡因子從線粒體內(nèi)釋放進入細胞質(zhì)，通過激活Caspase-3引起DNA片段化導(dǎo)致細胞凋亡[10,11]。已有研究證明多個線粒體依賴的凋亡途徑中都有線粒體分裂調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白Drp1的參與[12]。Drp1的負性突變或基因敲除可以減輕線粒體膜電位下降、CytC釋放和Caspase-3激活發(fā)揮細胞保護作用[13]。本研究結(jié)果顯示Aβ孵育后小膠質(zhì)細胞內(nèi)Drp1從細胞質(zhì)募集至線粒體，并繼之引起CytC釋放至細胞質(zhì)和Caspase-3激活，證明線粒體動力障礙參與Aβ引起小膠質(zhì)細胞激活及損傷過程，并繼之引起小膠質(zhì)細胞凋亡。Drp1主要位于細胞質(zhì)，受Fis1的招募轉(zhuǎn)位至線粒體潛在分裂位點，線粒體分裂后，Drp1重新回到細胞質(zhì)，如此循環(huán)反復(fù)[4]。Drp1的活性受翻譯后修飾及與其它物質(zhì)相互作用的影響[14]。Mdivi-1是一種Drp1的選擇性抑制劑[5]，本研究結(jié)果顯示mdivi-1可減少Drp1募集至線粒體和繼之引起的CytC釋放及Caspase-3激活，緩解Aβ引起小膠質(zhì)細胞線粒體分裂增加及隨后的凋亡過程。

圖2 4組小膠質(zhì)細胞存活率比較

圖3 3組小膠質(zhì)細胞凋亡水平及統(tǒng)計學分析（TUNEL染色，×40）

圖4 4組小膠質(zhì)細胞Drp1水平比較

圖5 Western blot法檢測4組小膠質(zhì)細胞CytC釋放（A）及Caspase-3激活（B）比較

綜上所述，本研究提示Mdivi-1對Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞凋亡具有保護作用，其可能機制為抑制線粒體/CytC/Caspase-3途徑，但具體作用機制有待進一步研究。

[1]Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of A lzheimer'sdisease:progressand problemson the road to therapeutics[J].Science,2002,297:353-356.

[2]Liu B,Hong JS.Role ofmicroglia in inflammation-mediated neurodegenerative diseases:mechanisms and strategies for therapeutic intervention[J].JPharmacol Exp Ther,2003,304:1-7.

[3]Luo XG,Ding JQ,Chen SD.microglia in the aging brain:relevance to neurodegeneration[J].MolNeurodegener,2010,5:12-12.

[4]Sm irnova E,Griparic L,Shurland DL,et al.Dynamin-related protein Drp1 is required formitochondrialdivision inmammalian cells[J].Mol BiolCell,2001,12:2245-2256.

[5]Cassidy-Stone A,Chipuk JE,Ingerman E,et al.Chemical inhibition of themitochondrial division dynam in reveals its role in Bax/Bak-dependent Mitochondrial outer membrane permeabilization[J].Dev Cell,2008,14:193-204.

[6]Grohm J,Kim SW,Mam rak U,etal.Inhibition of Drp1 provides neuroprotection in vitro and in vivo[J].Cell Death Differ,2012,19:1446-1458.

[7]Bueler H.Impaired mitochondrial dynamics and function in the pathogenesis of Parkinson's disease[J].Exp Neurol,2009,218:235-246.

[8]Manczak M,Calkins M J,Reddy PH.Impairedmitochondrial dynamics and abnormal interaction of amyloid betawithMitochondrialprotein Drp1 in neurons from patients with A lzheimer's disease:implications for neuronal damage [J].Hum Mol Genet,2011,20:2495-2509.

[9]Shirendeb U,Reddy AP,Manczak M,et al.AbnormalMitochondrial dynamics,Mitochondrial loss andmutant huntingtin oligomers in Huntington's disease:implications for selective neuronal damage[J].Hum Mol Genet,2011,20:1438-1455.

[10]Han Y,Lin Y,Xie N,et al.Impaired Mitochondrial biogenesis in hippocampi of rats with chronic seizures[J].Neuroscience,2011,194:234-240.

[11]Sola S,Morgado AL,Rodrigues CM.Death receptorsandMitochondria:two prime triggersof neural apoptosisand differentiation[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830:2160-2166.

[12]Frank S,Gaume B,Bergmann-Leitner ES,et al.The roleof dynam in-related protein 1,amediatorofMitochondrial fission,in apoptosis[J].Dev Cell,2001,1:515-525.

[13]Brooks C,Cho SG,Wang CY,et al.FragmentedMitochondria are sensitized to Bax insertion and activation during apoptosis[J].Am J PhysiolCellPhysiol,2011,300:C447-C455.

[14]M ishra N,Kar R,Singha PK,et al.Inhibition of Mitochondrial division through covalent modification of Drp1 protein by 15 deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin J2[J].Biochem Biophys ResCommun,2010,395:17-24.

Inhibition of Mitochond rial Fission A ttenuates Aβ-induced microglia Apoptosis

XIE Nan-chang,CHEN Chen,WANG Cui,ZHANG Qian,ZHANG Hong-wei,XIA Jian-hua,LIAN Ya-jun.Department of Neurology,the FirstAffiliated HospitalofZhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective:To investigate the neuroprotective effectofMitochondrial division inhibitor 1 (mdivi-1)on β-amyloid protein (Aβ)-induced apoptosis in BV-2 microglial cells.Methods:BV-2 microglial cells were random ly divided into controlgroup,Aβgroup,mdivi-1 group and Aβ+mdivi-1 group.Cellviability wasassessed by the reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny-ltetrazolium bromide(MTT).The apoptotic cells were determ ined by terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling (TUNEL)assay.The levels of dynam in-related protein 1(Drp1),cytochrome C(CytC)and caspase-3 expression of hippocampuswere measured by Western blotanalysis and the levelof CD11bmRNA was detected by RT-PCR.Results:Aβsignificantly reduced cellviability and increased apoptotic cells compared with controlgroup.Moreover,Aβinduced the expression of CD11b mRNA and increased the levels of Mito-Drp1,cyto-CytC and cleaved caspase-3 protein compared with control group.Mdivi-1 pretreatment significantly increased cell viability and decreased apoptotic cells compared with Aβgroup.Moreover,Mdivi-1 reduced the expression of CD11b mRNA and decreased the levels ofmito-Drp1,cyto-CytC and cleaved caspase-3 protein compared with controlgroup.Conclusion:Mdivi-1 exerts neuroprotective effects against Aβ-induced microglial apoptosis and the underlying mechanism may be through inhibiting CytC-dependentMitochondrialapoptosispathway.

β-amyloid protein;microglia;mitochondria;Mitochondrialdivision inhibitor1

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.002

1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科五病區(qū)b.內(nèi)科 鄭州450052

2.中國平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河南平頂山467100 3.駐馬店市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河南 駐馬店 463000

國家自然科學基金（No.81201012；No.81 371438）

2014-04 -02

連亞軍

yajunlian@163.com

（本文編輯：王晶）