傅里葉變換紅外光譜應(yīng)用于難治性細(xì)菌性陰道病診斷研究

李寧　譚珍媛　陳鐵寓等

[摘 要] 利用一維傅里葉變換紅外光譜法及二維紅外相關(guān)光譜法對(duì)難治性細(xì)菌性陰道病患者與正常婦女分泌物進(jìn)行研究，探討其一維、二維紅外光譜特征及其差異，為快速診斷難治性細(xì)菌性陰道病提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，病患者分泌物的一維紅外光譜主要具有如下特征：與蛋白質(zhì)、核酸、肽聚糖相關(guān)紅外吸收峰的峰強(qiáng)比I3380/I1460和I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460明顯升高，表明分泌物中蛋白質(zhì)、核酸、殼聚糖的含量升高，而與脂類相關(guān)的I2925/I1460則低于正常值表明分泌物中脂類含量降低。此外，患者酰胺I帶波數(shù)明顯降低，顯示其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與正常人的有明顯差異；結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)光譜和二維紅外光譜可以將患者與正常人的分泌物完全區(qū)分開來。初步研究表明，F(xiàn)T-IR有可能為快速診斷難治性細(xì)菌性陰道病提供一種新的方法和技術(shù)。

[關(guān)鍵詞] 難治性細(xì)菌性陰道??；診斷；傅里葉紅外，二維紅外

中圖分類號(hào)：R711.31 O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2014）05-001-04

[Abstract] The aim of the research was to establish the vaginal secretion basis for the recurrent BV by exploring a method to obtain 1D and 2D FT-IR spectrum of the secretion sample with FT-IR spectroscopy，and probing the characteristic features of recurrent BV compared with the normal ones. The results showed that the FT-IR spectrum of recurrent BV secretion was different from normal one： The ratio of I3380/I1460 and I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460 related to the protein，nuclear acid and chitosan were higher than in the normal one，which indicated their concentration increased in the secretion. The ratio of I2925/I1460 related to the lipid was lower than in the normal ones，which showed the relative quantity was less in the morbid secretion. Moreover，the amide band I of the patients obviously moved to lower wavenumber also indicated the secondary structure of related protein was different. Further research on the second derivative and 2D of FT-IR spectrum also unveiled great difference between the morbid and normal secretion. It can be concluded that FT-IR could be a potential method for rapid diagnosis of recurrent BV.

[Key words] recurrent BV；diagnosis；FT-IR；2D FT-IR

引言

細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）是陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)所致的一種混合性感染，感染菌群有加德納菌、動(dòng)彎桿菌、普雷沃菌、紫單胞菌、類桿菌等厭氧菌以及人型支原體[1]。難治性細(xì)菌性陰道病是指BV經(jīng)規(guī)范化治療3個(gè)療程癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)或1年發(fā)作4次以上者[2]。傳統(tǒng)的難治性細(xì)菌性陰道病確診過程需結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)、臨床病歷和復(fù)發(fā)史等進(jìn)行判斷，存在確診周期長、主觀性強(qiáng)的缺點(diǎn)[3]?；颊咄鶡o法及時(shí)獲得針對(duì)性治療，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化[4]，因此，急需建立一種快速而有效的診斷方法。

紅外光譜（Infrared Spectrometry，IR）具有快速，簡單可靠特點(diǎn)，可以在分子水平上反映組織和成分差異，已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門研究對(duì)象，近年來國內(nèi)外研究人員將其應(yīng)用在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)測定[5-6]、惡性腫瘤的快速診斷[7-9]，并取得了一定成果，有望成為新的診斷技術(shù)?；诖耍狙芯恐塾诟道锶~紅外光譜法，通過分析細(xì)菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在紅外光譜上存在的差異，探索其用于難治性細(xì)菌性陰道病診斷上的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)本取材和處理

陰道分泌物樣品均來自廣西南寧市婦女兒童醫(yī)院，經(jīng)菌群培養(yǎng)結(jié)合復(fù)發(fā)病史確診為難治性細(xì)菌性陰道病的患者和作為對(duì)照組的正常婦女各20例，接受取樣的對(duì)象均為年齡35-40歲的婦女。

樣品采集后，立即用酒精固定，真空干燥48h后按干重1：20混合KBr，每個(gè)樣品取200mg進(jìn)行壓片并測定紅外光譜。

1.2 儀器和數(shù)據(jù)處理

（1） Perkin Elmer Spectrum100 傅里葉變換紅外光譜儀，光譜范圍4000～450 cm-1，分辨率2 cm-1，得到陽性組和對(duì)照組各樣品的光譜圖后，測量相應(yīng)的陽性組與對(duì)照組各峰強(qiáng)比，數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最后分別求出陽性和對(duì)照組平均光譜圖。

（2）二階導(dǎo)數(shù)光譜：導(dǎo)數(shù)光譜的獲得采用Perkin Elmer公司Specturm v6.3.1操作軟件，平滑點(diǎn)數(shù)為13，分析范圍：1350～850 cm-1。

（3）二維相關(guān)紅外光譜： Perkin Elmer熱擾組件，升溫范圍：60～85℃，升溫速率1℃/1min，每隔5℃測定一次紅外光譜圖。二維相關(guān)紅外光譜的獲得采用Perkin Elmer公司的Transform二維相關(guān)分析軟件以及Matlab 5.7分析軟件，分析范圍：1200～850 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性組與對(duì)照組分泌物的一維紅外光譜分析比較

（1）與蛋白質(zhì)相關(guān)的譜帶：蛋白質(zhì)在紅外光譜區(qū)主要在3380cm-1，1650cm-1和1550cm-1處有吸收。其中3380cm-1附近的寬高峰由N-H單鍵的振動(dòng)引起，此外蛋白質(zhì)上的O-H伸縮振動(dòng)也在此有吸收。1650cm-1左右的尖吸收峰為蛋白質(zhì)的酰胺（CONH2）I帶，由酰胺的羰基伸縮振動(dòng)引起。1550cm-1左右的吸收峰為蛋白質(zhì)的酰胺II帶，由C≡N伸縮以及C-H的彎曲振動(dòng)引起。從表1可以看出，來自患者的樣品其紅外光譜的峰強(qiáng)比I3380/I1460以及I1550/I1460明顯升高，表明蛋白質(zhì)相對(duì)含量升高，其原因可能是患者的免疫系統(tǒng)受到病菌刺激，產(chǎn)生強(qiáng)烈的吞噬作用以及分泌各種蛋白酶。此外，患病組樣品1650cm-1左右酰胺I帶的吸收峰比對(duì)照組的向低波數(shù)移動(dòng)了5 cm-1左右，酰胺I帶為多個(gè)氨基酸殘基重疊而成的峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比例發(fā)生了變化，向低波數(shù)位移的幅度越大，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角比例也越多，相應(yīng)的α-螺旋所占的比例越小[10-11]。

（2）與脂類相關(guān)的譜帶：圖譜上與脂類相關(guān)的峰主要是2926cm-1，2854cm-1，1460cm-1以及1384cm-1。從表1可以看出，在患者的分泌物樣品中，I2925/I1460比值與正常人相比明顯降低，這表明脂類物質(zhì)含量減少。由于脂類可為機(jī)體提供能量，機(jī)體受到感染時(shí)，免疫系統(tǒng)吞噬、呼吸爆發(fā)等活動(dòng)加劇，新陳代謝的活動(dòng)增加，這種情況下脂類物質(zhì)將很難累積。

（3）與磷酸相關(guān)譜帶：圖譜上與核酸類相關(guān)的峰主要是1238cm-1、1079cm-1，分別由P=O雙鍵的彎曲振動(dòng)以及P-O單鍵的彎曲振動(dòng)引起。從表1可以看出，患者分泌物I1080/I1460較正常分泌物有大幅度的升高，表明磷脂及核酸物質(zhì)在增加。在機(jī)體對(duì)抗病菌過程中，人體免疫細(xì)胞以及病菌都會(huì)大量消亡，細(xì)胞死亡后大量構(gòu)成細(xì)胞膜的磷脂物質(zhì)將被釋放出來。此外，被感染部位的免疫細(xì)胞以及細(xì)菌分裂都比正常的迅速，因此遺傳物質(zhì)的含量明顯增加。

（4）與糖類相關(guān)的譜帶：細(xì)菌具有細(xì)胞壁，主要成分是肽聚糖，這是細(xì)菌區(qū)別于人體細(xì)胞的重要標(biāo)志，肽聚糖（peptidoglycan，其骨架是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1，4糖苷鍵交替相聯(lián)而組成的線狀聚糖鏈）在指紋區(qū)1026 cm-1通常有比較明顯的吸收峰。細(xì)菌被破壞后，肽聚糖被釋放出來，容易在紅外圖譜上呈現(xiàn)吸收峰[12]。從表1看，患者分泌物I1026/I1460強(qiáng)度幾乎為正常人的3倍，從圖1上看，患者平均光譜1026 cm-1處的吸收峰尖銳而明顯，強(qiáng)度甚至大于1079cm-1處的核酸吸收峰，而形成鮮明對(duì)比的是對(duì)照組在此處的吸收幾乎被埋沒。

2.2 陽性組與對(duì)照組分泌物的二階導(dǎo)數(shù)譜分析比較

為了更直觀地表示出難治性細(xì)菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在指紋區(qū)的差別，我們對(duì)二者的平均光譜進(jìn)行二階取導(dǎo)，二階導(dǎo)數(shù)譜圖見圖2、圖3。在1350-850cm-1的光譜區(qū)域內(nèi)，陽性組與對(duì)照組分泌物有明顯區(qū)別，前者在1195 cm-1、1437 cm-1、1008 cm-1、948 cm-1處出峰，而后者分別位移至1190 cm-1、1435cm-1、1011 cm-1、950 cm-1處。此外前者還在868 cm-1處多出1個(gè)峰。在1350～1150cm-1的區(qū)域內(nèi)，患者的分泌物在1295 cm-1、1198 cm-1、1164 cm-1處有明顯的3個(gè)峰，而正常婦女分泌物在這一區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)譜沒有出峰，譜線接近平滑，通過二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜已經(jīng)能將二者初步鑒別，下面將使用二維紅外圖譜對(duì)二者進(jìn)行深入鑒別。

2.3 陽性組與對(duì)照組分泌物的二維紅外光譜分析比較

難治性細(xì)菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在850～1200cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜見圖4、圖5。圖中左邊為二者的同步二維紅外平面相關(guān)譜，右邊為對(duì)應(yīng)的同步立體相關(guān)譜?？梢钥闯?，正常婦女分泌物在同步譜中的對(duì)角線位置出現(xiàn)5個(gè)自動(dòng)峰，分別在850cm-1、875cm-1、970 cm-1、1000cm-1、1025cm-1處，其中1000cm-1、1025cm-1處的自動(dòng)峰強(qiáng)度最大，而患者分泌物在850～1200cm-1區(qū)域?qū)蔷€僅850 cm-1、970cm-1處有較弱的自動(dòng)峰。此位置主要為酰胺及其衍生物的C-N彎曲振動(dòng)吸收區(qū)域。通過二維譜圖，說明患者分泌物中的酰胺C-N彎曲振動(dòng)隨溫度升高的變化遠(yuǎn)弱于正常分泌物。

3 結(jié)論

難治性細(xì)菌性陰道病的診斷一直是臨床醫(yī)學(xué)的難題之一。紅外光譜可以快速簡便地從分子水平檢測組織樣品，從物質(zhì)的組成和分子結(jié)構(gòu)方面提供依據(jù)，配合菌群培養(yǎng)診斷技術(shù)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足。本課題研究采取臨床取樣后KBr壓片獲取紅外光譜的方法，對(duì)難治性細(xì)菌性陰道病患者與正常婦女分泌物的光譜特點(diǎn)進(jìn)行了研究。二者在紅外光譜上有著較大不同，不論從物質(zhì)構(gòu)成、類型等方面均有較大差異，結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)、二維紅外相關(guān)光譜更能直觀地體現(xiàn)患者分泌物與正常人的不同，紅外光譜的操作也很方便。初步研究結(jié)果表明，傅里葉變換紅外光譜分析可能成為一種診斷難治性細(xì)菌性陰道病的新方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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