基于氨芐青霉素的抗污染根瘤菌劑制備技術(shù)

李劍峰等

摘 要 以微波輻照誘變獲得的紅豆草根瘤菌和苜蓿根瘤菌耐氨芐青霉素突變株為供試菌株，發(fā)酵培養(yǎng)至菌液活菌量達(dá)1×1010 cfu/mL時(shí)加氨芐青霉素至終濃度為200 mg/L，以該菌液制備液體抗污染菌劑或添加到滅菌泥炭中制成固體防污染菌劑。結(jié)果表明：菌劑中菌株生長(zhǎng)正常，菌株繁殖速度與無(wú)抗生素菌劑無(wú)顯著差異，加入滅菌泥炭制成的防污染菌劑儲(chǔ)藏120 d后的雜菌率僅為市面上購(gòu)得的普通根瘤菌劑雜菌率的11.89%～4.7%。表明該菌劑制備技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、活菌數(shù)高、雜菌率低的特點(diǎn)，能有效提高根瘤菌劑質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 氨芐青霉素；抗污染根瘤菌劑；制備技術(shù)

中圖分類號(hào)：S144.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1673-890X（2014）21--02

目前，根瘤菌劑已廣泛應(yīng)用于豆科作物及牧草栽培生產(chǎn)中，增產(chǎn)幅度可達(dá)10%～30%，用于新墾或低產(chǎn)田的增產(chǎn)效果更達(dá)71.2%～241%[1]。由于制備成本低，用量少，無(wú)毒害，無(wú)污染和增產(chǎn)明顯，根瘤菌劑的生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，并發(fā)展了一些新的品種和劑型。目前，根瘤菌劑產(chǎn)品面臨的主要問(wèn)題有：（1）高污染率。菌劑中有適宜包括環(huán)境雜菌在內(nèi)的多種微生物繁衍的養(yǎng)分條件。在產(chǎn)品制備運(yùn)輸過(guò)程中，微小破損也極易造成雜菌侵入引起菌劑嚴(yán)重污染，施用后不能發(fā)揮增產(chǎn)效應(yīng)甚至造成減產(chǎn)[2]，造成廠家和菌劑使用者嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，根瘤菌劑面臨著8%～32%的高污染率。尋求降低污染率的方法成為菌劑生產(chǎn)中的核心問(wèn)題。（2）目標(biāo)菌種與土著根瘤菌間的競(jìng)爭(zhēng)。土著根瘤菌已適應(yīng)了原生土壤環(huán)境，競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，新施入的目標(biāo)根瘤菌很難形成優(yōu)勢(shì)群落，因此占瘤率低下，高效根瘤比例少，增產(chǎn)作用受限。提高目標(biāo)菌株在土壤環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)力也是菌劑研發(fā)人員關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題；由此，擬探討以優(yōu)良根瘤菌的耐藥突變株，結(jié)合適當(dāng)濃度的氨芐青霉素制備抗污染菌劑解決上述問(wèn)題的可能性，為根瘤菌劑的研究應(yīng)用提供新的方法。

1 利用抗生素和耐藥菌株制作抗污染根瘤菌劑的方法

利用微波輻照（約800 W，1 min）處理紅豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌后，在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選，并進(jìn)行宿主植物回接實(shí)驗(yàn)。獲得固氮酶及結(jié)瘤能力不弱于原始菌株，在含300 mg/L氨芐青霉素的環(huán)境中生長(zhǎng)良好的紅豆草根瘤菌耐青霉素突變株RSW96[3]和苜蓿根瘤菌耐青霉素突變株LW107[4]。

取2種菌株活菌含量達(dá)到1×1010 cfu/mL的部分發(fā)酵菌液中緩慢加入氨芐青霉素并逐漸攪拌，使菌液中氨芐青霉素終濃度達(dá)到200 mg/mL，將此菌液加入磷酸緩沖液后制成液體菌劑在15～4 ℃下保存，或?qū)⒃摼禾砑尤霚缇萏亢笾瞥煽刮廴揪鷦5]；另取部分培養(yǎng)菌液加入800 mg/mL的氨芐青霉素，參照上文制成含高濃度抗生素的試樣，與含200 mg/mL氨芐青霉素的菌劑同條件下儲(chǔ)藏；再取部分培養(yǎng)菌液制成無(wú)抗生素的普通菌劑。對(duì)各試樣儲(chǔ)存65 d后進(jìn)行活菌數(shù)、雜菌數(shù)的測(cè)定；對(duì)菌劑進(jìn)行宿主回接實(shí)驗(yàn)測(cè)定目標(biāo)菌株占瘤率[5]。

2 菌劑測(cè)定結(jié)果

2.1 菌劑污染率

在高雜菌污染環(huán)境下放置90 d后，普通固體菌劑的平均雜菌含量為2.27×108 cfu/g，雜菌率達(dá)19.53%，而含200 mg/L氨芐青霉素的防污染固體菌劑平均雜菌率僅為0.3%～1.7%，雜菌中真菌和細(xì)菌的含量比普通菌劑分別降低14.5倍和11.12倍，能夠有效降低雜菌的污染[4]。

2.2 菌劑有效活菌數(shù)

紅豆草和苜?？刮廴竟腆w根瘤菌劑在保存65 d后活菌含量分別達(dá)到6.26×109 cfu/g和2.11×1010 cfu/g，分別是其普通固體菌劑活菌含量的302.41%和418.65%，差異極顯著（P<0.01）[3]。

2.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率

通過(guò)抗藥平板檢測(cè)法對(duì)使用普通菌劑和抗藥菌劑處理苜蓿（紅豆草）植株上的根瘤進(jìn)行檢測(cè)，普通菌劑目標(biāo)菌的平均占瘤率為58.07%（紅豆草）和73.12%（苜蓿），而抗污染菌劑處理的植株，目標(biāo)菌的占瘤率為68.67%和89.33%，差異顯著（P<0.05）。

3 優(yōu)點(diǎn)

3.1 適宜規(guī)模推廣和應(yīng)用

該技術(shù)可直接利用現(xiàn)有常規(guī)菌劑的生產(chǎn)設(shè)備和發(fā)酵工藝，菌株的誘變方法簡(jiǎn)便易行，抗生素和泥炭等原料易于購(gòu)置。降低了企業(yè)的技術(shù)改造和生產(chǎn)成本。

3.2 降低菌劑的污染率，提高活菌數(shù)

由于菌劑中含有廣譜抗菌物質(zhì)，菌劑在生產(chǎn)運(yùn)輸中即使接觸到少量雜菌也不會(huì)引起嚴(yán)重污染。貯藏過(guò)程中，隨著菌劑水分的散失，抑菌劑的濃度略增，對(duì)菌株會(huì)有微弱的代謝抑制，可促使菌株快速進(jìn)入休眠，減少菌種在儲(chǔ)存過(guò)程中因過(guò)量繁殖、營(yíng)養(yǎng)耗盡引起菌體大量死亡[4]。

3.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率

菌劑施用后，盡管抑菌劑稀釋后濃度降低，但仍對(duì)土著根瘤菌有抑制，會(huì)為目的菌株創(chuàng)造利于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的環(huán)境，使占瘤率增大，菌劑肥效作用更為明顯。

3.4 抑制土壤群落中的有害菌，減少農(nóng)藥使用量

氨芐青霉素會(huì)抑制土壤中的諸多病原菌。根瘤菌劑多用于拌種和苗期使用，菌劑中抗生素的降解過(guò)程與植物的生長(zhǎng)過(guò)程同步，在降解完成、藥效失去作用之前，可為幼苗期植株根系提供保護(hù)，減少農(nóng)藥的使用量，降低了土壤的農(nóng)藥污染。

3.5 降低菌劑生產(chǎn)過(guò)程對(duì)無(wú)菌環(huán)境的要求

該技術(shù)能夠降低菌劑生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)無(wú)菌環(huán)境的嚴(yán)格要求，菌劑生產(chǎn)廠家在設(shè)備和廠房上無(wú)需增加投入，在保證品質(zhì)的前提下降低了菌劑的生產(chǎn)成本。

3.6 使用簡(jiǎn)便，易于掌握

該技術(shù)原理簡(jiǎn)單易于理解，涉及的菌種篩選方法在科研和生產(chǎn)中已比較成熟，便于學(xué)習(xí)和操作，能夠適應(yīng)不同的生產(chǎn)和研發(fā)環(huán)境。適宜于大范圍的推廣和應(yīng)用。

4 與其他根瘤菌劑制備相關(guān)技術(shù)的區(qū)別

目前，嚴(yán)格控制生產(chǎn)和存儲(chǔ)環(huán)境凈度，嚴(yán)密封裝，菌劑低營(yíng)養(yǎng)化，凍干及固定化包埋菌種等方法均取得了良好的效果，但或者對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和工藝有一定要求，不利于降低成本，或者可能以損失大量的活菌，以降低菌肥品質(zhì)為代價(jià)降低污染。難以被中小菌劑廠家接受。而該技術(shù)利用常規(guī)菌株育種手段，不改變現(xiàn)有菌劑生產(chǎn)的設(shè)備和封裝條件，不涉及昂貴的儀器和復(fù)雜的技術(shù)，原料易購(gòu)易得，工藝簡(jiǎn)單，低成本，高收益，便于推廣[4]。

另外，目前多以基因工程手段提高菌株結(jié)瘤因子的表達(dá)強(qiáng)度來(lái)提高目的菌株的結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)力。但根瘤菌互接種族種類繁多，作物生境多樣，難以就每種作物在各具體生境下進(jìn)行基因改良。該技術(shù)能抑制作物根際土著根瘤菌的繁殖，使有抗性的目的菌在時(shí)間和空間上獲得優(yōu)勢(shì)。不同于轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的工程菌，誘變篩選得到的抗性菌株不存在轉(zhuǎn)基因菌株的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，使用的抑菌劑為氨芐青霉素，屬于可降解物質(zhì)，無(wú)污染，高效安全。但在施用時(shí)，菌劑需要稀釋以控制合理的抗生素釋放濃度，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)[4]。

參考文獻(xiàn)

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[2]Lupwayi NZ，Olsen PE，Sande ES，et al. Inoculant quality and its evaluation [J]. Field Crops Research，2000，65： 259-270.

[3]李劍峰，張淑卿，師尚禮.微波誘變選育高產(chǎn)生長(zhǎng)素及耐藥性根瘤菌株研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，（6）：981-985.

[4]李劍峰. 解磷根瘤菌誘變選育及抗污染菌劑制備關(guān)鍵技術(shù)研究[D].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011，97-112.

[5]師尚禮，李劍峰，曹文俠，等. 一種抗污染根瘤菌劑及其制作方法： 中國(guó)，CN101935238A[P]. 2009-07-02.

（責(zé)任編輯：劉昀）endprint