基于熒光卟啉傳感器陣列系統(tǒng)的肺癌標(biāo)志物檢測(cè)研究*

雷靳燦， 侯長(zhǎng)軍， 霍丹群

(重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030)

0 引 言

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)表現(xiàn)出高發(fā)病率和高死亡率，每年奪去上百萬人的生命[1]，資料顯示，這個(gè)數(shù)據(jù)還在不斷增加[2～4]。由于多數(shù)肺癌早期無明顯癥狀，而出現(xiàn)咳嗽、痰血等癥狀時(shí)被檢出來已是中晚期，使得在5年生存率不到15 %[5]，因此，對(duì)肺癌高危人群的篩查就顯得很有必要。然而，目前臨床上對(duì)肺癌早期的檢測(cè)手段主要依賴于X線,CT，MRI，PET等影像學(xué)手段。這些方法雖然無創(chuàng)，但價(jià)格昂貴，且對(duì)人體有一定危害，早期檢出率也并不理想，不適合廣泛用于肺癌篩查[6]。

Pauling L等人在1971年提出了肺癌呼出氣體檢測(cè)[7]，在早期檢測(cè)和篩查中具有廣泛的應(yīng)用前景，引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。研究表明，呼出氣體中的一些揮發(fā)性有機(jī)氣體(VOCs)與是否患有肺癌以及肺癌的分期有著密切的關(guān)系[8,9]，并已經(jīng)確定了呼出氣體中的一些肺癌標(biāo)志物[8,10～12]。近年來，越來越多的研究小組設(shè)計(jì)了針對(duì)肺癌相關(guān)VOCs的傳感器[13～15]，這也成為該領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。鑒于卟啉具有光敏特性好、響應(yīng)速度快、性能穩(wěn)定，采用光譜技術(shù)可以檢測(cè)到它的微小變化等優(yōu)點(diǎn)[16]，本文提出了一種與以往不同的熒光卟啉傳感器陣列系統(tǒng)，通過卟啉敏感材料與待測(cè)物之間的交叉響應(yīng)機(jī)制，對(duì)不同肺癌標(biāo)志物有著相當(dāng)好的識(shí)別效果。利用自主研發(fā)的熒光卟啉傳感器陣列系統(tǒng)，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的對(duì)二甲苯、苯乙烯、異戊二烯、己醛這4種肺癌標(biāo)志物進(jìn)行了識(shí)別區(qū)分，期望為后續(xù)臨床研究提供一定的支持。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 傳感器陣列

本文使用的熒光卟啉交叉響應(yīng)傳感器陣列由敏感物質(zhì)和基底材料構(gòu)成。敏感物質(zhì)均由重慶大學(xué)生化傳感中心自助合成并提供。首先通過熒光分光光度計(jì)分析各標(biāo)志物與敏感物質(zhì)溶液相互作用后的熒光光譜變化；然后將敏感物質(zhì)附于作為基底材料的聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，并根據(jù)熒光分光光度計(jì)的結(jié)果選用特定波長(zhǎng)的3個(gè)激光LED燈作為激發(fā)光源，配合微型光纖光譜儀進(jìn)行測(cè)試。通過前期研究的大量實(shí)驗(yàn)，篩選出包含卟啉、卟啉衍生物及指示劑染料在內(nèi)的共15種對(duì)肺癌呼出標(biāo)志物有不同熒光光譜響應(yīng)的敏感物質(zhì)。為便于系統(tǒng)設(shè)計(jì)，它們按圓形排列在直徑為47mm的PVDF膜上，構(gòu)成熒光卟啉傳感器陣列。

1.2 系統(tǒng)構(gòu)成

設(shè)計(jì)的熒光傳感器陣列檢測(cè)系統(tǒng)原理如圖1所示。

圖1 熒光傳感器檢測(cè)系統(tǒng)原理圖

系統(tǒng)上電后，微型PC發(fā)送控制指令使各硬件初始化。作為背景載氣的惰性氣體N2在氣泵的作用下進(jìn)入反應(yīng)氣室，各激光LED按一定流程打開關(guān)閉，傳感器陣列在步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)下旋轉(zhuǎn)，微型光纖光譜儀依次測(cè)量各敏感點(diǎn)反應(yīng)前的熒光光譜。隨后，用N2配好體積分?jǐn)?shù)的待測(cè)氣體進(jìn)入反應(yīng)氣室與傳感器陣列發(fā)生反應(yīng)，待反應(yīng)達(dá)到平衡后微型光纖光譜儀采集反應(yīng)后的熒光光譜。反應(yīng)前后的熒光光譜數(shù)據(jù)送入PC機(jī)，計(jì)算各敏感點(diǎn)的差譜并進(jìn)行分析處理。測(cè)量結(jié)束后氣體送入廢氣處理缸。

1.3 實(shí)驗(yàn)氣體

本文通過設(shè)計(jì)的系統(tǒng)對(duì)選擇的4種曾在多篇文獻(xiàn)中被確定為肺癌呼出標(biāo)志物的VOCs進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)志物由Sigma-Aldrich公司購(gòu)得的分析純使用N2作為背景氣體，將其配置成4種不同的體積分?jǐn)?shù)梯度，如表1所示。

表1 肺癌標(biāo)志物及其體積分?jǐn)?shù)

2 數(shù)據(jù)處理方法

對(duì)于每次待測(cè)VOCs的檢測(cè)，系統(tǒng)將自動(dòng)給出各敏感點(diǎn)反應(yīng)前后的熒光差譜數(shù)據(jù)，記為X1，X2，…，X15。結(jié)合光譜分析技術(shù)和信號(hào)處理技術(shù)，本文在熒光差譜的空間域上選取了3個(gè)特征指標(biāo)：峰峰值、最大峰位置、積分面積，分別記為：PPV(peak-to-peak value),MPP(maximum peak position),IA(integral area)，如圖2所示。

圖2 熒光差譜的空間域特征

峰峰值、最大峰位置描述的是光譜的個(gè)別局部點(diǎn)的特征，積分面積描述的是光譜的宏觀特征。而對(duì)于復(fù)雜系統(tǒng)而言，特別是本文中基于交叉響應(yīng)機(jī)制的識(shí)別，從信號(hào)分析處理的角度，還有必要關(guān)注其局部微觀特征，本文借助具有“數(shù)學(xué)顯微鏡”之稱的小波理論中的小波包進(jìn)行分析。使用db4小波包對(duì)Xi進(jìn)行三層分解，熒光差譜信號(hào)被分解到多個(gè)頻率，在各尺度空間內(nèi)的平滑信號(hào)和細(xì)節(jié)信號(hào)能提供原信號(hào)的時(shí)頻局部微觀信息，特別是原始信號(hào)在不同頻段上的構(gòu)成信息。因此，把不同頻段上的信號(hào)能量求出，便可作為熒光差譜信號(hào)的一組模式識(shí)別特征指標(biāo)。記末層各頻帶重構(gòu)信號(hào)為Sm(m=1,2,…,8)，則各頻帶重構(gòu)信號(hào)能量為

(1)

式中n為熒光差譜數(shù)據(jù)長(zhǎng)度。至此，對(duì)于每個(gè)敏感點(diǎn)均得到11個(gè)特征值：PPV，MPP，IA，E1～E8，將陣列上15個(gè)敏感點(diǎn)的特征值寫成向量形式，便構(gòu)成了目標(biāo)氣體可用于模式識(shí)別的特征向量，記為Y，顯然，Y是一個(gè)11×15=165維向量。

3 結(jié)果與討論

3.1 響應(yīng)熒光差譜

本文對(duì)上述4種體積分?jǐn)?shù)的4種標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每種標(biāo)志物每種體積分?jǐn)?shù)均測(cè)試10次，實(shí)驗(yàn)中設(shè)定標(biāo)志物與熒光傳感器陣列的反應(yīng)時(shí)間為15 min。通過系統(tǒng)給出的熒光差譜可以發(fā)現(xiàn)，不同標(biāo)志物的熒光差譜圖之間具有明顯的差別。以對(duì)二甲苯為例，4種體積分?jǐn)?shù)下的熒光差譜如圖3所示。

圖3 各體積分?jǐn)?shù)下對(duì)二甲苯的熒光差譜

可見，隨著濃度的增加，各敏感點(diǎn)的熒光差譜變化逐漸增大，但是，只有6個(gè)固定的特征點(diǎn)有熒光的變化，它們是X1，X4，X5，X8，X12，X15。其它3種標(biāo)志物也有類似的規(guī)律，即只有固定的敏感點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生熒光變化，說明系統(tǒng)對(duì)不同肺癌標(biāo)志物響應(yīng)的熒光差譜圖各不相同，具有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，這便構(gòu)成了不同標(biāo)志物的特有的指紋熒光差譜圖，如圖4所示。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以對(duì)不同肺癌標(biāo)志物進(jìn)行識(shí)別。

圖4 不同肺癌標(biāo)志物的指紋熒光差譜圖

3.2 層次聚類分析

層次聚類分析(HCA)是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠?qū)⑺^察的數(shù)據(jù)集內(nèi)的數(shù)據(jù)按照相似性的大小將它們聚集成族，從而達(dá)到分類的目的。它能在缺乏先驗(yàn)知識(shí)的情況下根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)合理進(jìn)行聚類，可作為小樣本下無監(jiān)督型模式識(shí)別的有力工具。本文從上述實(shí)驗(yàn)中的4種標(biāo)志物的20個(gè)樣本中分別隨機(jī)抽選5個(gè)，將它們的熒光光譜特征值Y作為輸入進(jìn)行層次聚類，結(jié)果如圖5所示。

圖5 4種肺癌標(biāo)準(zhǔn)物的層次聚類分析圖

顯然，4種肺癌標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確無誤的聚集。經(jīng)過多次隨機(jī)抽取，重復(fù)聚類，沒有錯(cuò)誤現(xiàn)象。

3.3 主成分分析

雖然HCA能夠?qū)⒉煌伟?biāo)志物進(jìn)行正確的區(qū)分，但由于特征向量Y的維數(shù)很高，這無疑將使得計(jì)算的復(fù)雜度較大，有必要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。主成分分析(PCA)的基本原理就是通過把各特征值進(jìn)行不同的線性組合構(gòu)建出新的指標(biāo)，即主成分，各主成分之間相互正交，這就使得能夠用最少的變量反映最多信息量成為可能。通過PCA對(duì)上述160次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一共提取到16個(gè)主成分，前3個(gè)主成分對(duì)原特征向量所包含信息的累積貢獻(xiàn)已達(dá)88 %，按照大于85 %的原則，文本只提取前3個(gè)主成分PC1，PC2，PC3，圖5中的樣本數(shù)據(jù)在以前3個(gè)主成分為坐標(biāo)的坐標(biāo)系中的散點(diǎn)圖如圖6所示，可見前3個(gè)主成分所代表的信息可以將不同肺癌標(biāo)志物進(jìn)行正確區(qū)分識(shí)別，能夠達(dá)到降低維數(shù)，簡(jiǎn)化計(jì)算的目的。

圖6 前3個(gè)主成分的樣本散點(diǎn)圖

4 結(jié) 論

本文提出了一種基于熒光卟啉傳感器陣列的肺癌呼出標(biāo)志物檢測(cè)系統(tǒng)，并據(jù)此對(duì)4種已確定的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，按照設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法提取了其特征向量，得到了其特有的指紋熒光圖譜。根據(jù)HCA,PCA等技術(shù)手段對(duì)它們進(jìn)行了識(shí)別區(qū)分，得到了理想的分類效果。HCA結(jié)果顯示，所有樣本均能夠正確的聚到一起。通過PCA，在前3個(gè)主成分所代表的88 %信息量的散點(diǎn)圖上便可將樣本明顯的區(qū)分。研究表明:該熒光卟啉傳感器陣列系統(tǒng)能夠快速有效的對(duì)肺癌標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)識(shí)別,若通過大量實(shí)驗(yàn)建立完整的肺癌標(biāo)志物特征數(shù)據(jù)庫，有望在臨床上應(yīng)用。

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