不同PCR擴(kuò)增試劑盒檢驗(yàn)血樣DNA的檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比研究

魏萬(wàn)昆

【摘要】 目的：討論研究Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16擴(kuò)增試劑盒用于檢驗(yàn)血樣DNA檢驗(yàn)結(jié)果的差異，并研究其擴(kuò)張不平衡和基因丟失現(xiàn)象的發(fā)生幾率。方法：選取150例完全無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體作為研究對(duì)象并采集其血樣，分別使用兩種擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)所得不同結(jié)果的同一對(duì)象再使用3種擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。將檢驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：3種試劑盒檢測(cè)的等位基因缺失率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測(cè)擴(kuò)張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05）。結(jié)論：使用PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)血樣DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)不同位置的異常基因，可表現(xiàn)為基因缺失及擴(kuò)增不平衡。但Profiler PlusTM檢驗(yàn)擴(kuò)增不平衡發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。在實(shí)際生活對(duì)血樣DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，除需準(zhǔn)備主要檢測(cè)擴(kuò)增試劑盒外，還需準(zhǔn)備其他不同類備用試劑盒用于互相驗(yàn)證及對(duì)比，盡量降低基因等位缺失及擴(kuò)張不平衡發(fā)生率。

【關(guān)鍵詞】 不同PCR擴(kuò)增試劑盒； 無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體； 血樣DNA檢驗(yàn)結(jié)果； 差異對(duì)比

【Abstract】 Objective：To discuss and study the difference between testing results of Profiler PlusTM， IdentifilerTM and Powerplex16 amplification kits in testing blood sample DNA， and study the occurrence rate of amplification imbalance and gene deletion phenomenon.Method：150 individuals who had no genetic connection with each other were chosen as research objects， and their blood samples were collected and tested by 2 different amplification kits. Objects with 2 different results were tested again by the third kit. All testing results were compared.Result：There were no significant differences between the 3 kits on allelic gene deletion （P<0.05）. Amplification imbalance rate of Profiler PlusTM was obviously higher than the other 2 kits （P<0.05）. Conclusion：When testing blood sample DNA with different PCR amplification kits， there might be abnormal genes of different positions which might manifested as gene deletion and amplification imbalance. But occurrence rate of amplification imbalance of testing result of Profiler PlusTM was obviously higher than the other 2 kits. In practical life， when testing blood sample DNA， besides major amplification kits， other different sorts of spare kits should be prepared for verification and comparison to reduce occurrence rates of allelic gene deletion and amplification imbalance.

【Key words】 Different PCR amplification kits； Individuals without genetic connection with each other； Blood sample DNA testing result； Difference comparison

First-authors address：The Second People's Hospital of Nanyang City，Nanyang 473000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.007

目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到基因分離、克隆，核酸序列分析，疾病診斷、DNA檢驗(yàn)等多個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)主要是指一種體外酶促合成特異DNA的方法。近年來(lái)DNA檢驗(yàn)技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛使用，主要遺傳系統(tǒng)包括Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16，可在各類犯罪案件、數(shù)據(jù)庫(kù)管理重建等項(xiàng)目中得到廣泛應(yīng)用[1-2]。大部分研究證明，使用這三種PCR擴(kuò)增試劑盒漸漸結(jié)果科學(xué)性及可靠性高，具有較高的實(shí)用價(jià)值。但是該檢驗(yàn)仍然會(huì)出現(xiàn)基因缺失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)為研究不同擴(kuò)增試劑盒用于檢驗(yàn)血樣DNA結(jié)果的差異與臨床價(jià)值，特選取150例無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體臨床資料進(jìn)行分析?，F(xiàn)將報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取150例完全無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體，所有個(gè)體均為漢族，其中男64例，女36例；年齡26～42歲，平均（34.3±8.2）歲。100例個(gè)體均來(lái)源于本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)積累。設(shè)備儀器使用ABI公司提供ABI3100型基因分析儀以及9700型PPCR擴(kuò)增儀器。endprint

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)所有血樣采集檢驗(yàn)個(gè)體均使用硅珠法進(jìn)行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴(kuò)增。使用ABI-9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測(cè)方法等根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴(kuò)增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴(kuò)增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序?yàn)閟et F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因型分型。對(duì)于IdentifilerTM以及Powerplex16擴(kuò)增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴(kuò)增試劑盒等位基因確實(shí)及擴(kuò)增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴(kuò)增試劑盒不同檢驗(yàn)結(jié)果分型為8例。檢驗(yàn)差異率為8.0%。使用3種擴(kuò)增試劑盒對(duì)上述8例血液樣本再次進(jìn)行DNA血樣檢測(cè)后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴(kuò)增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測(cè)的等位基因缺失率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測(cè)擴(kuò)張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 3種擴(kuò)增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實(shí)驗(yàn)個(gè)體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實(shí)際和檢驗(yàn)存在7個(gè)樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的5個(gè)樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴(kuò)增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個(gè)等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對(duì)于同一個(gè)基因座在引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點(diǎn)突變的緣故，部分個(gè)體的樣本在擴(kuò)增時(shí)因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴(kuò)增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴(kuò)增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗(yàn)中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴(kuò)增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個(gè)等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計(jì)選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個(gè)基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個(gè)等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個(gè)等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個(gè)等位基因片段太大沒(méi)能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測(cè)范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴(kuò)增效率角度，而小片段等位基因易與先擴(kuò)增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時(shí)基因序列發(fā)生點(diǎn)突變可能導(dǎo)致樣本擴(kuò)增時(shí)部分個(gè)體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴(kuò)增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴(kuò)增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴(kuò)增試劑盒對(duì)血樣DNA檢驗(yàn)分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個(gè)等位基因片段過(guò)大造成未對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，導(dǎo)致超過(guò)檢驗(yàn)范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對(duì)所有基因缺失及擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對(duì)小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴(kuò)增率相對(duì)較低且易于優(yōu)先擴(kuò)增[11-12]。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增及監(jiān)測(cè)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種不同擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達(dá)8 ng。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對(duì)模版DNA量大小無(wú)明顯差異，因此在實(shí)際應(yīng)用中可類同把握。對(duì)于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴(kuò)增試劑盒均會(huì)出現(xiàn)等位基因丟失及擴(kuò)張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實(shí)際檢驗(yàn)操作過(guò)程中可選擇主要一類擴(kuò)增試劑盒，其異常百分比可相對(duì)較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對(duì)比分析時(shí)可進(jìn)行檢測(cè)，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯(cuò)誤發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)所有血樣采集檢驗(yàn)個(gè)體均使用硅珠法進(jìn)行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴(kuò)增。使用ABI-9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測(cè)方法等根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴(kuò)增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴(kuò)增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序?yàn)閟et F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因型分型。對(duì)于IdentifilerTM以及Powerplex16擴(kuò)增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴(kuò)增試劑盒等位基因確實(shí)及擴(kuò)增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴(kuò)增試劑盒不同檢驗(yàn)結(jié)果分型為8例。檢驗(yàn)差異率為8.0%。使用3種擴(kuò)增試劑盒對(duì)上述8例血液樣本再次進(jìn)行DNA血樣檢測(cè)后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴(kuò)增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測(cè)的等位基因缺失率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測(cè)擴(kuò)張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 3種擴(kuò)增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實(shí)驗(yàn)個(gè)體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實(shí)際和檢驗(yàn)存在7個(gè)樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的5個(gè)樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴(kuò)增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個(gè)等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對(duì)于同一個(gè)基因座在引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點(diǎn)突變的緣故，部分個(gè)體的樣本在擴(kuò)增時(shí)因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴(kuò)增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴(kuò)增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗(yàn)中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴(kuò)增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個(gè)等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計(jì)選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個(gè)基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個(gè)等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個(gè)等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個(gè)等位基因片段太大沒(méi)能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測(cè)范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴(kuò)增效率角度，而小片段等位基因易與先擴(kuò)增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時(shí)基因序列發(fā)生點(diǎn)突變可能導(dǎo)致樣本擴(kuò)增時(shí)部分個(gè)體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴(kuò)增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴(kuò)增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴(kuò)增試劑盒對(duì)血樣DNA檢驗(yàn)分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個(gè)等位基因片段過(guò)大造成未對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，導(dǎo)致超過(guò)檢驗(yàn)范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對(duì)所有基因缺失及擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對(duì)小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴(kuò)增率相對(duì)較低且易于優(yōu)先擴(kuò)增[11-12]。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增及監(jiān)測(cè)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種不同擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達(dá)8 ng。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對(duì)模版DNA量大小無(wú)明顯差異，因此在實(shí)際應(yīng)用中可類同把握。對(duì)于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴(kuò)增試劑盒均會(huì)出現(xiàn)等位基因丟失及擴(kuò)張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實(shí)際檢驗(yàn)操作過(guò)程中可選擇主要一類擴(kuò)增試劑盒，其異常百分比可相對(duì)較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對(duì)比分析時(shí)可進(jìn)行檢測(cè)，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯(cuò)誤發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)所有血樣采集檢驗(yàn)個(gè)體均使用硅珠法進(jìn)行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴(kuò)增。使用ABI-9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測(cè)方法等根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴(kuò)增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴(kuò)增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序?yàn)閟et F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因型分型。對(duì)于IdentifilerTM以及Powerplex16擴(kuò)增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴(kuò)增試劑盒等位基因確實(shí)及擴(kuò)增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴(kuò)增試劑盒不同檢驗(yàn)結(jié)果分型為8例。檢驗(yàn)差異率為8.0%。使用3種擴(kuò)增試劑盒對(duì)上述8例血液樣本再次進(jìn)行DNA血樣檢測(cè)后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴(kuò)增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測(cè)的等位基因缺失率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測(cè)擴(kuò)張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 3種擴(kuò)增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實(shí)驗(yàn)個(gè)體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實(shí)際和檢驗(yàn)存在7個(gè)樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的5個(gè)樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴(kuò)增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個(gè)等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對(duì)于同一個(gè)基因座在引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點(diǎn)突變的緣故，部分個(gè)體的樣本在擴(kuò)增時(shí)因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴(kuò)增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴(kuò)增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗(yàn)中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴(kuò)增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個(gè)等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計(jì)選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個(gè)基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個(gè)等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個(gè)等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個(gè)等位基因片段太大沒(méi)能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測(cè)范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴(kuò)增效率角度，而小片段等位基因易與先擴(kuò)增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時(shí)基因序列發(fā)生點(diǎn)突變可能導(dǎo)致樣本擴(kuò)增時(shí)部分個(gè)體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴(kuò)增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴(kuò)增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴(kuò)增試劑盒對(duì)血樣DNA檢驗(yàn)分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個(gè)等位基因片段過(guò)大造成未對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，導(dǎo)致超過(guò)檢驗(yàn)范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對(duì)所有基因缺失及擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對(duì)小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴(kuò)增率相對(duì)較低且易于優(yōu)先擴(kuò)增[11-12]。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增及監(jiān)測(cè)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種不同擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達(dá)8 ng。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對(duì)模版DNA量大小無(wú)明顯差異，因此在實(shí)際應(yīng)用中可類同把握。對(duì)于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴(kuò)增試劑盒均會(huì)出現(xiàn)等位基因丟失及擴(kuò)張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實(shí)際檢驗(yàn)操作過(guò)程中可選擇主要一類擴(kuò)增試劑盒，其異常百分比可相對(duì)較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對(duì)比分析時(shí)可進(jìn)行檢測(cè)，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯(cuò)誤發(fā)生。

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（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint