高效液相色譜法測定稻米中二甲戊靈殘留的研究

周天倚，楊仁斌，龍智勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)保研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082）

二甲戊靈，又名二甲戊樂靈，化學(xué)名稱：N-1-（乙基丙基）-2，6-二硝基-3，4-二甲基苯胺[N-（1-ethylpropy）-3，4-dimethyl-2，6-dinitrobenzenamine]，分子式C13H19N3O4，分子量為281.3，結(jié)構(gòu)式見圖1[1]；其在水中的溶解度為 0.5 mg/L，熔點為54～58℃；該藥在130℃以下的環(huán)境下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，揮發(fā)性小，不易光解，易溶于丙酮、二甲苯等大多數(shù)有機溶劑，屬于二硝基苯胺類除草劑[2]。

圖1 二甲戊靈結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of Pendimethalin

二甲戊靈是一種新型的低毒高效旱田除草劑，主要適用于防除玉米、大豆、小麥、花生和棉花等多種旱地作物的馬唐、狗尾草、金狗尾草等1年生禾本科和闊葉雜草[3]；其作用機理主要是通過抑制雜草芽和根的分生組織分裂，使其不能生長而死亡[4]。目前，該除草劑也在多種蔬菜和果樹上使用[5]。

近年來，由于該除草劑的廣泛使用，因而對其分析研究也日漸增多。例如：二甲戊靈在豆類[6-7]、青菜[8]、大蒜[9]及水果[10]中的殘留分析研究，以及二甲戊靈的藥理作用[11-15]和毒理作用[16-17]研究等。目前，用于二甲戊靈殘留分析的主要方法有固相分離反相液相色譜法[15]、高效液相色譜法[18-20]、毛細管氣相色譜法[21]和氣相色譜法[22]等，但二甲戊靈在稻米中的殘留分析方法還未見報道。試驗采用高效液相色譜法檢測稻米中的二甲戊靈，旨在建立一種適用于我國實驗室條件的稻米中二甲戊靈的殘留檢測分析方法，為開展二甲戊靈在水稻中的殘留毒理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗主要試劑：二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度為99.6%，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所），甲醇（色譜純和分析純），丙酮、石油醚、二氯甲烷（均為分析純），無水硫酸鈉（600℃條件下烘8 h，分析純），弗羅里硅土（60～100目，分析純）。供試稻米為先農(nóng)1號，采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地。

試驗主要儀器：SPD-20A高效液相色譜儀（配紫外檢測器和工作站，自帶安捷倫Exlend C18不銹鋼柱，5 μm×250 mm×4.6 mm，美國Agilent科技有限公司）；AEU-210萬分之一分析天平（廈門欣銳儀器儀表有限公司）；KQ-100E超聲波洗滌儀（昆山市超聲波儀器有限公司）；KYC-1102C恒溫振蕩儀（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；棕色容量瓶（100 mL）及具塞三角瓶（250 mL）等實驗室常用儀器設(shè)備。

1.2 試驗方法

1.2.1 二甲戊靈的提取與凈化 準(zhǔn)確稱取10 g稻米于250 mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL分析純甲醇，在恒溫振蕩儀上30℃振蕩提取1 h后取出冷卻至室溫；經(jīng)減壓抽濾過濾，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干；加少量淋洗液（V石油醚︰V二氯甲烷= 75︰25）在超聲波作用下溶解；再定量轉(zhuǎn)移到層析柱（層析柱從下至上依次填有棉花、2 cm無水硫酸鈉、5 g弗羅里硅土、2 cm無水硫酸鈉，填充好的柱子先用10 mL石油醚潤濕淋洗柱子）上，用40 mL淋洗液（同上）淋洗層析柱；收集全部淋出液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，用色譜甲醇溶解并過0.22 μm有機膜后定容至5 mL，待HPLC測定。

1.2.2 二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.526 g二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)樣品，用色譜甲醇溶解并轉(zhuǎn)至100 mL棕色容量瓶中，配成500 mg/L的母液備用；用梯度稀釋法分別配制2.500、1.250、0.500、0.250、0.125、0.050 的mg/L系列二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 HPLC檢測條件 （1）檢測波長：用SPD-20高效液相色譜儀在200～400 nm波長范圍內(nèi)對0.5 mg/L的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外掃描，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來選擇最佳測試波長。（2）流動相：固定高效色譜儀的柱溫（30℃）、檢測波長（238 nm）、流速（1 mL/min）等條件，在流動相的比例V甲醇︰V水=70︰30～90︰10的范圍內(nèi)選定若干個不同體積比的流動相，對濃度為0.5 mg/L的二甲戊靈標(biāo)液進行檢測，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來選擇最優(yōu)的流動相配比。（3）柱溫：固定高效色譜儀的檢測波長（238 nm）、流動相比例（V甲醇︰V水=85︰15）及流速（1 mL/min）等檢測條件，在20～40℃范圍內(nèi)依次遞增5℃對0.5 mg/L的二甲戊靈標(biāo)液進行檢測，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來確定最優(yōu)的檢測溫度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將不同濃度的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳檢測條件下測定，以二甲戊靈進樣濃度與相對應(yīng)的色譜峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 檢測方法精密度的測定 在最佳檢測條下對添加了0.5 mg/L二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的稻米樣品連續(xù)測定5次，對峰面積數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)變異系數(shù)來衡量方法的精密度。

1.2.6 添加回收試驗 在空白稻米樣品中加入0.1、0.2、2.0 mg/kg 的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法提取、凈化、濃縮、定容、檢測，每個添加濃度重復(fù)5次，計算添加回收率，并作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳檢測波長

由圖2可知，波長在238 nm和248 nm時，干擾較小，峰形較完整；但波長為238 nm時峰面積大于波長為248 nm時的峰面積，因此選擇238 nm為該方法的最佳檢測波長。

2.2 最佳流動相比例

根據(jù)出峰的時間和與雜質(zhì)的分離程度，從圖3中可看出，在甲醇與水的體積比為75︰25和80︰20時，二甲戊靈不能出峰（峰面積幾乎為零）；而比例為85︰15和90︰10時，峰的分離程度較好，但比例為85︰15時的峰面積明顯比90︰10時的大，表明在V甲醇︰V水=85︰15時，對二甲戊靈的靈敏度較高，更有利于低濃度二甲戊靈的檢測；同時，V甲醇︰V水=90︰10時，出峰時間在6.4 min，容易受到樣品中雜質(zhì)峰的干擾，影響到測定結(jié)果。因此，選擇V甲醇︰V水=85︰15作為該方法的最佳流動相比例。

2.3 柱溫的確定

從表1中看出，在不同柱溫條件下，出峰時間和峰面積有一定的差異，其中以20和25℃時，峰面積較大，但是其出峰時間較遲，容易與雜質(zhì)峰重疊。因此，綜合考慮之后確定30℃為最佳柱溫。該試驗結(jié)果與李永新等[19]的研究結(jié)果一致。

圖2 在不同檢測波長下二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖Fig.2 Chromatography of Pendimethalin under different wavelength

圖3 流動相比例不同時二甲戊靈的色譜圖Fig.3 Chromatography of Pendimethalin under different percentages of mobile phase

表1 色譜柱溫對二甲戊靈的影響Table 1 Effects of different temperatures of chromatogram columnon Pendimethalin

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將不同濃度的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，在流動相V甲醇︰V水= 85︰15 、流速1 mL/min、檢測波長238 nm、柱溫30℃、進樣量20 μL的檢測條件下進行測定，以二甲戊靈進樣濃度與相對應(yīng)的色譜峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。結(jié)果表明，二甲戊靈的濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y = 111 826 x＋990.32，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。這說明該檢測條件可以滿足0～2.500 mg/L范圍內(nèi)二甲戊靈的檢測。在此條件下，二甲戊靈的檢測圖譜清晰、分離度較好、峰形完整（圖5）。

圖4 二甲戊靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of Pendimethalin

圖5 二甲戊靈標(biāo)樣的色譜圖Fig.5 Chromatogram of standard Pendimethalin sample

2.5 方法精密度

在最佳檢測條下，對添加了0.5 mg/L二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的稻米樣品連續(xù)測定5次，其峰面積分別為60 988、61 293、60 553、61 078和61 573 mAU·s，變異系數(shù)為0.619%。這表明該方法精密度較好，儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較高。

2.6 添加回收率測定

從表2中看出，當(dāng)二甲戊靈在稻米中添加濃度為0.1、0.2、2.0 mg/kg 時，添加回收率為87.40%～ 94.16%，變異系數(shù)為3.38%～6.70%，儀器最小檢出限為9.14×10-12g，方法最低檢出濃度為0.005 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留量分析方法的技術(shù)要求[4]。

表2 二甲戊靈在稻米中添加的回收率Table 2 Recoveries of Pendimethalin in rice

3 結(jié)論與討論

使用HPLC檢測稻米中二甲戊靈的方法有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。試驗結(jié)果表明，最佳檢測條件為：檢測波長238 nm，流動相比例V甲醇︰V水= 85︰15，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。在該檢測條件下，對稻米添加標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為87.40%～94.16%，變異系數(shù)為3.38%～6.70%，儀器最小檢出限為9.14×10-12g，方法最低檢出濃度為0.005 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。這表明該方法可用于稻米中的二甲戊靈殘留檢測。

在提取和凈化稻米樣品中的二甲戊靈時，采取了過層析柱的措施，大大降低了稻米中雜質(zhì)對提取結(jié)果的影響。該措施充分利用了二甲戊靈的水溶性較低、易被有機溶劑萃取的特性，同時對抽濾過程中進入濾液的米粒起到了過濾作用，對其他雜質(zhì)也有較好的分離效果，大大提高了檢測樣品中的二甲戊靈純度，有效避免了雜質(zhì)的干擾。

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