木薯疫霉根腐病病原初步鑒定及其生物學特性測定

盧昕+李超萍+裴月令+郭涵+時濤+黃貴修

摘 要 2010年11月，在對海南省儋州市的木薯病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種根腐病。經(jīng)致病性評價，分離獲得病原菌。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲無分隔，孢囊梗呈簡單合軸分枝，孢子囊多頂生，倒梨形，厚垣孢子大量產(chǎn)生，球形、頂生。形態(tài)觀察結(jié)果初步表明，其為棕櫚疫霉（Phytophthora palmivora）。ITS序列分析表明，其和幾株棕櫚疫霉（HQ237481，HQ237478和HQ237477）的序列同源性為99%。生物學特性研究表明，OA或CMA培養(yǎng)基、26～30℃、pH 5、D-木糖醇、乙酸銨、光暗交替是病菌生長最適條件，菌絲致死溫度為50℃，10 min。

關(guān)鍵詞 木薯 ；疫霉根腐病 ；生物學特性

分類號 S435.33

Preliminary Identification of a Pathogen Causing Phytophthora Root Rot Disease of Cassava and Its Biological Characteristics

LU Xin1） LI Chaoping2） PEI Yueling2） GUO Han2） SHI Tao2） HUANG Guixiu2）

（1 Environment and Plant Protection College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， P. R. China；

2 Environment and Plant Protection Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops /

Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，

CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract A cassava root rot disease was found in Danzhou of Hainan Province during a survey in November 2010. The pathogen was isolated with following Koch's postulates. Microscopic observation results showed the mycelium wasn't separated， the sporangiophore were simple sympodial branches. Most of the sporangium were formed on the top， obpyriform. The chlamydospores were spherical， formed on the top and produced abundantly. The preliminary results showed the pathogen was Phytophthora palmivora， and the ITS sequence had homology of 99% with several sequences （e.g.， GenBank Accession Nos. HQ237481， HQ237478， and HQ237477） of P. palmivora. The optimal condition for the mycelium growth included OA or CMA medium， 26℃ to 30℃， pH 5， D-xylitol， ammonium acetate and alternative light， and the lethal temperature of mycelium was 55℃ for 10 min.

Keywords Cassava ； Phytophthora palmivora ； Biological characteristics

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬大戟科木薯屬植物，原產(chǎn)于南美洲的亞馬遜河流域，是三大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一，也是世界六億以上人口的主要熱量來源。木薯廣泛栽培于南北緯30°之間，海拔2 000 m以下，年均氣溫18°以上的熱帶和部分亞熱帶地區(qū)。木薯也是我國熱區(qū)重要的經(jīng)濟作物，主要用于生產(chǎn)淀粉和酒精，是我國最大的生物能源產(chǎn)業(yè)。據(jù)國家木薯產(chǎn)業(yè)體系的統(tǒng)計，2013年種植面積47.33萬hm2，鮮薯總產(chǎn)量1054.7萬t。

國外研究表明，疫霉屬[1]、腐霉屬[2]和鐮刀菌屬[3]等多種病原菌均可為害木薯根部，但國內(nèi)尚無相關(guān)報道。2010年11月，筆者在海南省儋州市的木薯田里（品種為華南205）發(fā)現(xiàn)一種根腐病。病原菌主要危害塊根，嚴重影響植株的長勢而降低產(chǎn)量和品質(zhì)。開展該病的病原分離、鑒定及生物學特性研究，為進一步開展防控技術(shù)等研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫霉根腐病病樣和木薯品種

木薯疫霉根腐病病根采自海南省儋州市的發(fā)病木薯田。供試木薯品種為‘華南205，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種與資源研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

所需培養(yǎng)基和試劑分別參照方中達[4]和時濤等[5]的方法進行制備和購買，引物ITS1和ITS4參照WHITE T J等[6]的序列進行合成。endprint

1.2 方法

1.2.1 木薯疫霉根腐病病菌的分離和致病性測定

田間采集植株發(fā)病塊根，參照方中達[4]的方法分離和純化病原菌。

參照J.A. Ekundayo和Theresa M. D[7]的方法進行致病性測定。具體方法如下：用孔徑為0.6 cm的打孔器在PDA平板上培養(yǎng)一周的菌落邊緣打取菌餅，選取新鮮無病的木薯塊根，自來水沖洗干凈，在4%次氯酸鈉溶液中消毒3 min再用無菌水沖洗3次，晾干。在木薯塊根上選取同一橫截面的4個位置，用無菌的打孔器打取1個厚度約0.4 cm的薯釘，其中3個放入菌餅，另外1個放入同樣大小的無菌PDA培養(yǎng)基塊作對照，蓋回薯釘，28℃保濕處理。28℃保濕培養(yǎng)7 d后去掉菌餅和培養(yǎng)基塊，觀察發(fā)病情況。從病斑上重新分離病原菌，觀察其菌落及孢子囊等性狀，并與接種菌株進行比較。

1.2.2 木薯疫霉根腐病病菌的鑒定

參照易潤華等[8]的方法進行病原菌基因組DNA的提取。參照鄭小波[9]、時濤等[5]的方法進行病原菌落形態(tài)、孢子囊等結(jié)構(gòu)的觀察和測量，ITS序列分析和生物學特性研究，其中菌絲致死溫度設(shè)42、44、46、48、50、52、54℃等處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯疫霉根腐病病菌的分離

筆者在海南省儋州市發(fā)現(xiàn)了木薯根腐病。塊根受侵染后，出現(xiàn)灰白色、灰黑色或黃褐色，規(guī)則或不規(guī)則的變色現(xiàn)象。嚴重時病斑不斷擴大，逐漸深入根內(nèi)部，最終局部或整個根部組織呈海綿狀腐爛變褐，并產(chǎn)生刺激性的酸臭味（圖1）。從華南205的病薯中分離到1株病原菌，編號為：CPPHN01。

致病性測定結(jié)果表明，菌株能夠在塊根上形成與田間癥狀類似的變色現(xiàn)象，而對照只是出現(xiàn)輕微的褐變（圖2）。從發(fā)病部位重新獲得了培養(yǎng)性狀與接種菌株一致的分離物，表明該菌株為該病的致病菌。田間發(fā)病情況類似的癥狀。

2.2 木薯疫霉根腐病病菌CPPHN01的鑒定

2.2.1 CPPHN01的形態(tài)觀察

菌株在PDA平板上，形成圓形的菌落，邊緣較整齊。菌落白色，邊緣淺黃色，氣生菌絲較旺盛（圖3a）。病原菌的菌絲無分隔。菌落表面的孢囊梗呈簡單合軸分枝；孢子囊多頂生，倒梨形，29.3～52.8 μm×22.3～35.1 μm，長寬比1.3～1.5，有較明顯的單個乳突。孢子囊具脫落性，孢囊柄短，長1.3～5.0 μm（圖3b）。孢子囊成熟后釋放球形的游動孢子，排孢孔寬3～8 μm。厚垣孢子大量產(chǎn)生，球形、頂生，大小為27.9～40.1 μm（圖3c）。參照陸家云[10]的相關(guān)記載，初步鑒定該病病原菌為疫霉屬的棕櫚疫霉（Phytophthora palmivora）。

2.2.2 CPPHN01的rDNA ITS序列分析

采用PCR擴增獲得了CPPHN01的rDNA ITS序列，分析結(jié)果表明，其全長為873 nt，已提交NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為HE580279。序列比對結(jié)果表明，它和幾株棕櫚疫霉（HQ237481，HQ237478和HQ237477）的序列同源性為99%。

2.3 CPPHN01生物學特性研究

CPPHN01在供試的8種培養(yǎng)基上均能正常生長，而在OA和CMA培養(yǎng)基上生長速度最快，分別為1.44和1.48 cm/d（圖4）。CPPHN01生長的最適條件為26～30℃（1.12～1.15 cm/d，圖5）、pH 5（0.94 cm/d，圖6）和光暗交替（1.21 cm/d，圖7）。最適碳源D-木糖醇（0.88 cm/d，圖8），最適氮源乙酸銨（0.95 cm/d，圖9），D-木糖、草酸銨則抑制其生長。不同的高溫處理結(jié)果表明，50℃以上的高溫處理后菌絲即失去了生長能力，表明菌絲的致死溫度為50℃處理10 min（圖10）。

3 討論與結(jié)論

2010年，筆者首次在海南省儋州市發(fā)現(xiàn)根腐病。隨后的調(diào)查結(jié)果表明，該病在云南保山、廣東湛江等木薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。地勢低洼、排水不良、過度密植等造成田間濕度大的田塊發(fā)病重，地下害蟲為害和臺風影響同樣會加重病害的嚴重度。從發(fā)病木薯上采集病樣，分離病原菌，經(jīng)顯微形態(tài)觀察和ITS序列分析，初步鑒定其為棕櫚疫霉。

病原菌的生物學特性研究結(jié)果表明，生長最適條件為OA或CMA培養(yǎng)基，26到30℃，D-木糖醇，乙酸銨，pH5和光暗交替。碳氮源中，D-木糖和草酸銨能夠抑制病原菌的生長。菌絲致死溫度為50℃，10 min。馮巖等[11]也對侵染番木瓜的棕櫚疫霉進行了生物學特性研究，結(jié)果表明V8培養(yǎng)基，pH 5.5～7.2，26～28℃，蔗糖和蛋白胨為其生長最適條件，硫酸銨則抑制其生長。鄭金龍等[12]發(fā)現(xiàn)，侵染劍麻的棕櫚疫霉在26～28℃，pH 6.0～7.0，CA培養(yǎng)基上生長最好。這些不同寄主來源的病原菌在生物學特性方面存在著差異，表明菌株之間存在著變異。

棕櫚疫霉是一種多寄主的植物病原真菌，能夠侵染馬拉巴栗[13]、昆士蘭瓶樹[14]等觀賞樹木，番荔枝[15]、橡膠樹[16]、可可樹[17]、胡椒、菠蘿[18]等熱帶經(jīng)濟特色經(jīng)濟作物，也能夠侵染泡桐、柑橘、冬青[16]等北方植物。木薯和橡膠樹均為大戟科植物，以前僅在橡膠樹上有棕櫚疫霉的發(fā)生報道，本研究所分離的CPPHN01和危害橡膠樹的菌株有什么異同點，還需要進行進一步的研究。

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