小麥矮稈種質(zhì)系山農(nóng)342—9矮稈基因的分子標(biāo)記定位

張明　吳瑕　張一鐸等

摘要：為了明確小麥矮稈種質(zhì)系山農(nóng)342-9矮稈性狀的遺傳特點，本研究對其赤霉酸敏感性及矮稈性狀的遺傳特點進行了鑒定分析，利用分子標(biāo)記技術(shù)對矮稈基因進行了分子標(biāo)記定位。結(jié)果表明，山農(nóng)342-9為赤霉酸不敏感型，其矮稈性狀受一對位于小麥6B染色體上的隱性主效基因控制；從2 606對引物中篩選出2個與矮稈基因連鎖的分子標(biāo)記Xwmc398和Xgwm508，利用F2分離群體計算出它們與矮稈基因的遺傳距離分別為1.2 cM和8.1 cM。

關(guān)鍵詞：小麥；矮稈種質(zhì)系；矮稈基因；分子標(biāo)記定位

中圖分類號：S512.103.53文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）07-0007-04

AbstractThe GA sensitivity， genetic characteristics of dwarfing traits of Shannong 342-9 were identified and analyzed by field investigation. And the dwarfing gene was located by molecular maker technology. The results showed that Shannong 342-9 was insensitive to GA， and its dwarfing gene was a recessive gene on chromosome 6B. Two SSR markers linked to dwarfing gene， Xwmc398 and Xgwm508， were identified from 2 606 pairs of primers. And their genetic distances with dwarfing gene were calculated with F2 segregation population，which were 1.2 cM and 8.1 cM respectively.

Key wordsWheat； Dwarfing germplasm line； Dwarfing gene； Molecular mapping

20世紀(jì)60年代引發(fā)的“綠色革命”[1，2]育成與推廣了許多矮稈、半矮稈小麥品種，如農(nóng)林10號和日本赤小麥等，對世界小麥產(chǎn)量的提高起了關(guān)鍵作用。時至今日，來自農(nóng)林10號的Rht-B1b、Rht-D1b和日本赤小麥的Rht8、Rht9矮稈基因仍被廣泛應(yīng)用于小麥育種中，矮化育種已經(jīng)成為小麥高產(chǎn)育種的一條重要途徑[3]。雖然目前發(fā)現(xiàn)的小麥矮稈基因已有20余個[4]，但是在小麥生產(chǎn)中高達90%以上的矮稈與半矮稈品種攜帶有來自農(nóng)林10號和赤小麥的矮稈基因[5]，矮源的單一化導(dǎo)致了小麥育成品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此，不斷創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)新的矮源，豐富矮稈基因的多樣性，對于促進小麥育種水平的提高具有重要意義[6]。

自20世紀(jì)80年代以來，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展有效促進了遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，為小麥基因的標(biāo)記定位提供了更為直接有效的方法?？茖W(xué)家們建立了多個小麥矮稈基因相關(guān)的分子標(biāo)記。Peng等[7]克隆了Rht-B1b和Rht-D1b的同源基因；Ellis等[8]將赤霉酸敏感型基因Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12和Rht13運用SSR技術(shù)進行了標(biāo)記；Korzun等[9]篩選出了與Rht8緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm261。目前科學(xué)家們已經(jīng)利用分子標(biāo)記技術(shù)對Rht-B1c[10]、Rht-D1c[11]、Rht12[12]矮稈基因進行了標(biāo)記定位。分子標(biāo)記技術(shù)已成為對目標(biāo)基因進行定位的有效方法[13]。

山農(nóng)342-9是本實驗室從小冰麥與泰農(nóng)18雜交后代中選育出的矮稈種質(zhì)系。株高60 cm左右，莖稈粗壯，籽粒飽滿，高抗白粉病和條銹病，綜合農(nóng)藝性狀較好，后期不早衰。本研究對其株高性狀的遺傳特點進行了分析，并對其矮稈基因進行了分子標(biāo)記定位。

1材料與方法

1.1試驗材料

矮稈小麥種質(zhì)山農(nóng)342-9，高稈小麥種質(zhì)山農(nóng)1532和對赤霉酸敏感的中國春。以山農(nóng)1532為母本、山農(nóng)342-9為父本雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，從F2中選出10株典型高稈單株和10株典型矮稈單株種成F2∶3家系。

1.2試驗方法

1.2.1赤霉酸敏感性鑒定取山農(nóng)342-9和中國春飽滿且大小一致的種子各50粒，置于培養(yǎng)皿中進行室溫浸種。待種子萌動后在4℃冰箱中放置24 h，使其出苗整齊。從冰箱中取出種子播在盛有沙土的容器內(nèi)。每個材料設(shè)處理組與對照組，播在不同容器內(nèi)，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗條件下生長。處理組每天噴施100 μg/L的赤霉酸溶液，對照組每天噴施等量的清水，兩周后調(diào)查幼苗株高[14]。

1.2.2田間株高調(diào)查供試材料種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)農(nóng)學(xué)實驗站，種植行長1.6 m，行距0.3 m，株距0.1 m。于乳熟期進行株高調(diào)查，親本的株高取10株的平均值，F(xiàn)1的株高取20株的平均值，F(xiàn)2株高按每個單株的實際值記載。

1.2.3DNA提取取材料葉片在液氮中研磨成粉末，加入800 μL SDS提取緩沖液，65℃水浴30 min，冷卻后加400 μL乙酸銨，離心10 min后取上清液移至另一管中，再加等體積的異丙醇，離心10 min后棄上清，加70%乙醇洗滌，干燥后加ddH2O溶解保存[15]。

1.2.4PCR擴增PCR擴增體系為10 μL，其中引物2 μL，ddH2O 1.5 μL，DNA 1.5 μL，剩余5 μL為2×Taq PCR Master Mix。擴增程序參照郝元峰等[16]的方法。

1.2.5電泳使用8%聚丙烯酰胺凝膠變性膠，玻璃板垂直電泳，恒定功率400 W，3 h，電泳完成后進行硝酸銀染色顯影并照相保存[17]。

1.2.6分子標(biāo)記定位采用優(yōu)選小群體分析法[18]，在F2分離群體中分別選取10株典型的高稈植株和10株典型的矮稈植株，利用在親本中篩選出的多態(tài)性引物進行PCR擴增與基因型檢測，用得到的連鎖標(biāo)記，進一步在分離群體中進行驗證分析，計算標(biāo)記與基因之間的連鎖遺傳距離。利用卡方檢驗驗證F2分離群體中表型的分離比例，運用JoinMap4.0軟件繪制遺傳連鎖圖譜。最后用F2∶3家系驗證。

2結(jié)果與分析

2.1山農(nóng)342-9的赤霉酸反應(yīng)特點

赤霉酸敏感性試驗結(jié)果（圖1）表明，山農(nóng)342-9在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比不增加，而對赤霉酸敏感的中國春在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比明顯增加，說明山農(nóng)342-9對赤霉酸不敏感。

3討論

本研究對矮稈種質(zhì)系山農(nóng)342-9矮稈性狀的遺傳特點進行了分析，明確了其矮稈性狀受一對隱性主效基因控制。篩選出2個與矮稈基因連鎖的SSR標(biāo)記（Xwmc398、Xgwm508），其中Xwmc398與矮稈基因間的遺傳距離為1.2 cM，可用于矮稈基因的分子標(biāo)記輔助選擇。山農(nóng)342-9的矮稈基因定位于小麥6B染色體上，目前尚沒有發(fā)現(xiàn)定位在小麥6B染色體上的矮稈基因，因此該基因可能是一個新基因，具有較大的研究價值。

參考文獻：

[1]金善寶.中國小麥學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：223-224.

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[11]劉秉華，楊麗，丁表珍.小麥顯性矮稈基因Rht10與著絲點間遺傳距離的測定[J].科學(xué)通報，1993，38（12）：1128-1130.

[12]Korzun V， Rder M， Worland A J，et al.Intrachromosomal mapping of genes for dwarfing（Rht12） and vernalization response（Vrn1） in wheat by using RFLP and microsatellite markers[J].Plant Breeding，1997，116（3）：227-232.

[13]康蘇花，蘭素缺，柏峰，等.小麥矮稈基因的研究進展[J].河北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，34（1）：93-97.

[14]郭保宏.小麥矮稈遺傳型對赤霉酸反應(yīng)的初步研究[J].作物品種資源，1989（3）：132-151.

[15]Saghai-Maroof M A， Soliman K， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley：mendelian inheritance，chromosomal location and population dynamics[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81（24）：8014-8018.

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[18]宗浩，崔法，王洪剛，等.小麥矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495矮稈基因的分子標(biāo)記定位[J].麥類作物學(xué)報，2009，29（3）：385-389.

1.2.6分子標(biāo)記定位采用優(yōu)選小群體分析法[18]，在F2分離群體中分別選取10株典型的高稈植株和10株典型的矮稈植株，利用在親本中篩選出的多態(tài)性引物進行PCR擴增與基因型檢測，用得到的連鎖標(biāo)記，進一步在分離群體中進行驗證分析，計算標(biāo)記與基因之間的連鎖遺傳距離。利用卡方檢驗驗證F2分離群體中表型的分離比例，運用JoinMap4.0軟件繪制遺傳連鎖圖譜。最后用F2∶3家系驗證。

2結(jié)果與分析

2.1山農(nóng)342-9的赤霉酸反應(yīng)特點

赤霉酸敏感性試驗結(jié)果（圖1）表明，山農(nóng)342-9在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比不增加，而對赤霉酸敏感的中國春在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比明顯增加，說明山農(nóng)342-9對赤霉酸不敏感。

3討論

本研究對矮稈種質(zhì)系山農(nóng)342-9矮稈性狀的遺傳特點進行了分析，明確了其矮稈性狀受一對隱性主效基因控制。篩選出2個與矮稈基因連鎖的SSR標(biāo)記（Xwmc398、Xgwm508），其中Xwmc398與矮稈基因間的遺傳距離為1.2 cM，可用于矮稈基因的分子標(biāo)記輔助選擇。山農(nóng)342-9的矮稈基因定位于小麥6B染色體上，目前尚沒有發(fā)現(xiàn)定位在小麥6B染色體上的矮稈基因，因此該基因可能是一個新基因，具有較大的研究價值。

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[18]宗浩，崔法，王洪剛，等.小麥矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495矮稈基因的分子標(biāo)記定位[J].麥類作物學(xué)報，2009，29（3）：385-389.

1.2.6分子標(biāo)記定位采用優(yōu)選小群體分析法[18]，在F2分離群體中分別選取10株典型的高稈植株和10株典型的矮稈植株，利用在親本中篩選出的多態(tài)性引物進行PCR擴增與基因型檢測，用得到的連鎖標(biāo)記，進一步在分離群體中進行驗證分析，計算標(biāo)記與基因之間的連鎖遺傳距離。利用卡方檢驗驗證F2分離群體中表型的分離比例，運用JoinMap4.0軟件繪制遺傳連鎖圖譜。最后用F2∶3家系驗證。

2結(jié)果與分析

2.1山農(nóng)342-9的赤霉酸反應(yīng)特點

赤霉酸敏感性試驗結(jié)果（圖1）表明，山農(nóng)342-9在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比不增加，而對赤霉酸敏感的中國春在苗期噴施赤霉酸溶液后株高與噴施等量清水的對照組株高相比明顯增加，說明山農(nóng)342-9對赤霉酸不敏感。

3討論

本研究對矮稈種質(zhì)系山農(nóng)342-9矮稈性狀的遺傳特點進行了分析，明確了其矮稈性狀受一對隱性主效基因控制。篩選出2個與矮稈基因連鎖的SSR標(biāo)記（Xwmc398、Xgwm508），其中Xwmc398與矮稈基因間的遺傳距離為1.2 cM，可用于矮稈基因的分子標(biāo)記輔助選擇。山農(nóng)342-9的矮稈基因定位于小麥6B染色體上，目前尚沒有發(fā)現(xiàn)定位在小麥6B染色體上的矮稈基因，因此該基因可能是一個新基因，具有較大的研究價值。

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[11]劉秉華，楊麗，丁表珍.小麥顯性矮稈基因Rht10與著絲點間遺傳距離的測定[J].科學(xué)通報，1993，38（12）：1128-1130.

[12]Korzun V， Rder M， Worland A J，et al.Intrachromosomal mapping of genes for dwarfing（Rht12） and vernalization response（Vrn1） in wheat by using RFLP and microsatellite markers[J].Plant Breeding，1997，116（3）：227-232.

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