云厚樸大紫丹參清除DPPH·的作用

魏澤英，孫海林，楊文標(biāo)，李麗梅

摘要：目的采用DPPH·法，測(cè)定云厚樸SFE-CO2萃取液、乙醇提取液和大紫丹參水提取液清除DPPH·自由基的活性。方法通過(guò)在樣品中加入DPPH·，測(cè)定吸光度的改變，計(jì)算清除率%和C50。結(jié)果云厚樸SFE-CO2萃取液C50=4.83μg/mL，云厚樸乙醇提取液C50=4.17μg/mL；尚未達(dá)到C50時(shí)，大紫丹參水提取液的清除曲線就趨于平緩。結(jié)論云厚樸SFE-CO2萃取液、乙醇提取液和大紫丹參水提取液都具有清除DPPH·自由基的活性，大紫丹參水提取液清除DPPH·自由基的作用較弱。

關(guān)鍵詞：DPPH·；抗氧化；云厚樸；大紫丹參

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2014）04-0057-03

EffectofMagnoliaOfficinalisandRadixSalviaeMiltiorrhizaeonDPPH·Scavenging

WEIZe-ying，SUNHai-lin，YANGWen-biao，etal.

（SchoolPharmacy，YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，Yunnan）

【Abstract】Objective：DPPHmethodwasusedtomeasuretheDPPHradicalscavengingactivityofSFE-CO2extractandethanolextractfromMagnoliaOfficinalisandwaterextractfromRadixSalviaeMiltiorrhizae.Methods：DPPHwasaddedintothesampletomeasureabsorbancechangesandtocalculateclearancerateandC50.Results：TheSFE-CO2extractC50=4.83μg/mLandtheethanolextractC50=4.17μg/mL.WhennotyetreachingC50，theclearancecurveofthewaterextractfromRadixSalviaeMiltiorrhizaewasinclinedtobeflat.Conclusion：TheSFE-CO2extractandtheethanolextractfromMagnoliaOfficinalisandthewaterextractfromRadixSalviaeMiltiorrhizaehavethefreeradicalactivityofscavengingDPPHandthewaterextractfromRadixSalviaeMiltiorrhizaehasaweakfreeradicalofscavengingDPPH.

【Keywords】DPPH，antioxidant，MagnoliaOfficinalis，RadixSalviaeMiltiorrhizae

中藥厚樸為木蘭科植物厚樸（MagnoliaofficinalisRehd.etwils）的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥。厚樸性溫，味苦辛，入脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕化痰、下氣除滿的功能，主治濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等癥[2]。厚樸酚與和厚樸酚是厚樸中的活性成分，對(duì)自由基引起的感染、癌癥、老化、白內(nèi)障及自身免疫障礙等疾病的治療有益，厚樸酚與和厚樸酚具有的抗氧化活性，可抑制細(xì)胞中產(chǎn)生的H2O2，O2-，OH-[3]。云厚樸來(lái)源于木蘭科植物滇緬厚樸（MagnoliarostrataW.W.Smith）的干燥干皮、根皮及枝皮，活性成分與正品厚樸類似。云厚樸對(duì)DPPH·的清除研究未見報(bào)道。

丹參為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥，藥典收載品為唇形科植物丹參（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖。丹參味苦，微寒，入心、心包、肝經(jīng)。具有活血化瘀、涼血消癰及養(yǎng)血安神的功效，多用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞、心動(dòng)過(guò)速、腦血栓等。原兒茶醛、咖啡酸為水溶性丹酚酸類的主要成分，隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA為脂溶性的丹參酮類的主要組成[4]。大紫丹參為褐毛甘西鼠尾草（SalviaprzewalskiiMaxim.var.mandarinorum（Diels）Stibal）的干燥根和根莖，是云南省習(xí)用丹參藥材之一，主產(chǎn)于滇西北，活性成分與正品丹參類似。大紫丹參對(duì)DPPH·的清除研究未見報(bào)道。

DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，分子式C18H12N5O6，分子量394.32）是暗紫色大棱柱晶體，其醇溶液呈深紫色，其穩(wěn)定性主要來(lái)自3個(gè)苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間位阻。其分光光度法測(cè)定原理是依據(jù)DPPH·在乙醇溶液中最大吸收波長(zhǎng)在517nm處，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸減弱、消失，其褪色程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光度值下降，且下降程度呈線性關(guān)系，因此可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化能力。DPPH·法于1958被提出，是用以評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏可行的方法[5]。

厚樸、丹參的治療作用與其抗氧化活性有關(guān)。云厚樸、大紫丹參是云南省的習(xí)用藥材，其抗氧化活性的研究可以進(jìn)一步探明云厚樸、大紫丹參及其制劑的藥用機(jī)理。本文研究了云厚樸的SFE-CO2（CO2超臨界流體萃?。┹腿∫汉鸵掖继崛∫?、大紫丹參（麗江產(chǎn)、會(huì)澤產(chǎn)）水提液在無(wú)水乙醇介質(zhì)中清除DPPH·的活性。

1儀器與材料

1.1儀器UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）），SFE-CO2裝置（型號(hào)：HA221-50-06，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），CO2氣體（昆明氧氣廠，食品級(jí)純度99.9%），MettlerToledoAl204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。endprint

1.2材料云厚樸藥材購(gòu)于昆明菊花村中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為木蘭科植物滇緬厚樸（MagnoliarostrataW.W.Smith）的干燥干皮；麗江產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于麗江，會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于會(huì)澤，兩個(gè)產(chǎn)地的大紫丹參經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為甘西鼠尾草（SalviaprzewalskiiMaxim.var.mandarinorum（Diels）Stibal）的干燥根。

DPPH·（BR.）（上海凱洋生物技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇（AR.）（天津大茂化學(xué)試劑廠）；厚樸酚對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110729-200411）；蘆?。ㄗ灾疲?。

2方法與結(jié)果

2.1云厚樸提取物的制備及含量測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取厚樸酚對(duì)照品3.0mg，置50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解，定容，得濃度為60μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取厚樸酚對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于10mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，在293nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.03414c+0.01765（R2=0.9996）。

2.1.2云厚樸提取物的制備云厚樸SFE-CO2萃取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩備用。按萃取壓力30MPa，萃取溫度45℃，分離壓力7MPa，分離溫度35℃，85%乙醇為夾帶劑，CO2為20L/h，提取時(shí)間2.5h條件下進(jìn)行萃取[6]。萃取液稀釋3倍，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算，得出該萃取液的總酚含量為46μg/mL。

云厚樸乙醇提取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩，加80%乙醇加熱回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為10倍量，8倍量。合并濾液，回收乙醇，氯仿萃取，旋干，無(wú)水乙醇定容[7]，測(cè)定吸光度，得出該提取液的總酚含量為49μg/mL。

2.2大紫丹參水提取物的制備取大紫丹參（麗江產(chǎn)、會(huì)澤產(chǎn)）適量，粉碎過(guò)40目篩，加蒸餾水回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為15倍量、20倍量。合并濾液，得大紫丹參水提取液。

2.3DPPH·溶液的制備精密稱取DPPH·26.1mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度261μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.4蘆丁溶液的制備精密稱取蘆丁4.7mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度47μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.5波長(zhǎng)-吸光度之間的關(guān)系掃描DPPH·無(wú)水乙醇溶液，考察其紫外吸收情況，測(cè)定結(jié)果顯示，在無(wú)水乙醇介質(zhì)中，DPPH·的最大吸收在516nm附近，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為516nm。

2.6DPPH·溶液顯色穩(wěn)定性考察精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)放置1h內(nèi)，DPPH·溶液吸光度基本不變。

精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，加入樣品，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)呈線性降低，但30min后，吸光度的變化已經(jīng)很小，故確定反應(yīng)30min后，迅速測(cè)定吸光度，保證在5min內(nèi)測(cè)完。

2.7DPPH·溶液濃度-吸光度之間的關(guān)系精確吸取DPPH·溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置30s后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，DPPH·濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得出線性方程為A=0.5825c-0.0023（R2=0.9991）。說(shuō)明DPPH·濃度與吸光度之間有線性關(guān)系，可據(jù)此了解加入樣品反應(yīng)后剩余DPPH·的含量。

2.8測(cè)定方法精密吸取1mLDPPH·溶液，加入一定量的提取液，定容至10mL，放置30min，測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，取平均值計(jì)算。以蘆丁溶液的抗氧化實(shí)驗(yàn)與提取液進(jìn)行比較，以下式計(jì)算清除率：

清除率%=（1-AiA0）×100%

A0：1mLDPPH·溶液定容為10mL的吸光度平均值

Ai：1mLDPPH·溶液加入提取液定容為10mL的吸光度平均值

清除率越大，抗氧化活性越高。將清除50%DPPH·所需樣品量定義為C50，C50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

2.9測(cè)定結(jié)果按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，云厚樸SFE-CO2萃取液、云厚樸乙醇提取液、蘆丁溶液清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1云厚樸SFE-CO2萃取液、乙醇提取液、

蘆丁溶液清除DPPH·曲線

由圖計(jì)算出：C50（云厚樸SFE-CO2萃取液）=4.83μg/mL，C50（云厚樸乙醇提取液）=4.17μg/mL，C50（蘆?。?4.70μg/mL。

按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，麗江產(chǎn)大紫丹參、會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2大紫丹參（麗江、會(huì)澤）水提取液清除DPPH·曲線

由圖可見，尚未達(dá)到C50時(shí)，曲線就趨于平緩。

3小結(jié)與討論

云厚樸SFE-CO2萃取液清除DPPH·的作用與蘆丁相當(dāng)，云厚樸乙醇提取液清除DPPH·的作用強(qiáng)于SFE-CO2提取液，可能是由于乙醇提取液總酚含量較高。酚類化合物抗氧化的活性，主要是由于它們的還原特性，這種還原特性在中性自由基消除單線態(tài)和三線態(tài)氧或是分解過(guò)氧化物中具有重要作用。厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的作用機(jī)理已有初步研究[3]，但云厚樸提取液的清除機(jī)理與純品溶液是否一致，其機(jī)理如何尚有待進(jìn)一步研究。

大紫丹參水提取液清除DPPH·的作用較弱，還沒有達(dá)到C50，曲線就趨于平緩。麗江產(chǎn)大紫丹參與會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·的作用沒有明顯區(qū)別。丹參及其制劑治療心腦血管疾病的作用與其提取物具有抗氧化活性有關(guān)，通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生從而保護(hù)心臟免受傷害[8]。夏華鑫等研究認(rèn)為丹參水提取液中，丹酚酸B的抗氧化作用最強(qiáng)，丹酚酸B可能是丹參通過(guò)清除氧自由基治療心血管疾病的重要活性成分[9]。大紫丹參的抗氧化活性有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[9]夏華鑫，劉梅，張志敏.丹參水溶性成分體外抗氧化活性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（5）：1086-1087.

（收稿日期：2014-02-12）endprint

1.2材料云厚樸藥材購(gòu)于昆明菊花村中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為木蘭科植物滇緬厚樸（MagnoliarostrataW.W.Smith）的干燥干皮；麗江產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于麗江，會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于會(huì)澤，兩個(gè)產(chǎn)地的大紫丹參經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為甘西鼠尾草（SalviaprzewalskiiMaxim.var.mandarinorum（Diels）Stibal）的干燥根。

DPPH·（BR.）（上海凱洋生物技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇（AR.）（天津大茂化學(xué)試劑廠）；厚樸酚對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110729-200411）；蘆?。ㄗ灾疲?/p>

2方法與結(jié)果

2.1云厚樸提取物的制備及含量測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取厚樸酚對(duì)照品3.0mg，置50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解，定容，得濃度為60μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取厚樸酚對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于10mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，在293nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.03414c+0.01765（R2=0.9996）。

2.1.2云厚樸提取物的制備云厚樸SFE-CO2萃取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩備用。按萃取壓力30MPa，萃取溫度45℃，分離壓力7MPa，分離溫度35℃，85%乙醇為夾帶劑，CO2為20L/h，提取時(shí)間2.5h條件下進(jìn)行萃取[6]。萃取液稀釋3倍，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算，得出該萃取液的總酚含量為46μg/mL。

云厚樸乙醇提取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩，加80%乙醇加熱回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為10倍量，8倍量。合并濾液，回收乙醇，氯仿萃取，旋干，無(wú)水乙醇定容[7]，測(cè)定吸光度，得出該提取液的總酚含量為49μg/mL。

2.2大紫丹參水提取物的制備取大紫丹參（麗江產(chǎn)、會(huì)澤產(chǎn)）適量，粉碎過(guò)40目篩，加蒸餾水回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為15倍量、20倍量。合并濾液，得大紫丹參水提取液。

2.3DPPH·溶液的制備精密稱取DPPH·26.1mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度261μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.4蘆丁溶液的制備精密稱取蘆丁4.7mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度47μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.5波長(zhǎng)-吸光度之間的關(guān)系掃描DPPH·無(wú)水乙醇溶液，考察其紫外吸收情況，測(cè)定結(jié)果顯示，在無(wú)水乙醇介質(zhì)中，DPPH·的最大吸收在516nm附近，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為516nm。

2.6DPPH·溶液顯色穩(wěn)定性考察精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)放置1h內(nèi)，DPPH·溶液吸光度基本不變。

精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，加入樣品，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)呈線性降低，但30min后，吸光度的變化已經(jīng)很小，故確定反應(yīng)30min后，迅速測(cè)定吸光度，保證在5min內(nèi)測(cè)完。

2.7DPPH·溶液濃度-吸光度之間的關(guān)系精確吸取DPPH·溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置30s后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，DPPH·濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得出線性方程為A=0.5825c-0.0023（R2=0.9991）。說(shuō)明DPPH·濃度與吸光度之間有線性關(guān)系，可據(jù)此了解加入樣品反應(yīng)后剩余DPPH·的含量。

2.8測(cè)定方法精密吸取1mLDPPH·溶液，加入一定量的提取液，定容至10mL，放置30min，測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，取平均值計(jì)算。以蘆丁溶液的抗氧化實(shí)驗(yàn)與提取液進(jìn)行比較，以下式計(jì)算清除率：

清除率%=（1-AiA0）×100%

A0：1mLDPPH·溶液定容為10mL的吸光度平均值

Ai：1mLDPPH·溶液加入提取液定容為10mL的吸光度平均值

清除率越大，抗氧化活性越高。將清除50%DPPH·所需樣品量定義為C50，C50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

2.9測(cè)定結(jié)果按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，云厚樸SFE-CO2萃取液、云厚樸乙醇提取液、蘆丁溶液清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1云厚樸SFE-CO2萃取液、乙醇提取液、

蘆丁溶液清除DPPH·曲線

由圖計(jì)算出：C50（云厚樸SFE-CO2萃取液）=4.83μg/mL，C50（云厚樸乙醇提取液）=4.17μg/mL，C50（蘆?。?4.70μg/mL。

按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，麗江產(chǎn)大紫丹參、會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2大紫丹參（麗江、會(huì)澤）水提取液清除DPPH·曲線

由圖可見，尚未達(dá)到C50時(shí)，曲線就趨于平緩。

3小結(jié)與討論

云厚樸SFE-CO2萃取液清除DPPH·的作用與蘆丁相當(dāng)，云厚樸乙醇提取液清除DPPH·的作用強(qiáng)于SFE-CO2提取液，可能是由于乙醇提取液總酚含量較高。酚類化合物抗氧化的活性，主要是由于它們的還原特性，這種還原特性在中性自由基消除單線態(tài)和三線態(tài)氧或是分解過(guò)氧化物中具有重要作用。厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的作用機(jī)理已有初步研究[3]，但云厚樸提取液的清除機(jī)理與純品溶液是否一致，其機(jī)理如何尚有待進(jìn)一步研究。

大紫丹參水提取液清除DPPH·的作用較弱，還沒有達(dá)到C50，曲線就趨于平緩。麗江產(chǎn)大紫丹參與會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·的作用沒有明顯區(qū)別。丹參及其制劑治療心腦血管疾病的作用與其提取物具有抗氧化活性有關(guān)，通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生從而保護(hù)心臟免受傷害[8]。夏華鑫等研究認(rèn)為丹參水提取液中，丹酚酸B的抗氧化作用最強(qiáng)，丹酚酸B可能是丹參通過(guò)清除氧自由基治療心血管疾病的重要活性成分[9]。大紫丹參的抗氧化活性有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S]（一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010﹕235-237.

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[3]保志娟，楊雪瓊，鄒永明，等.厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的作用[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，27（1）：60-63.

[4]鄭國(guó)墀.丹參化學(xué)成分的研究概況[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1989，24（1）：69-73.

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[6]鄧義德，指導(dǎo)：梁曉原.乙醇對(duì)超臨界CO2萃取云厚樸總酚影響的研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31（4）：31-34.

[7]鄧義德，劉海周，曹瑋娟，等.云厚樸兩種提取方法的比較研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（2）：32-38.

[8]唐忠志，唐瑛.丹參對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌病變及血液流變學(xué)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（2）：9-12.

[9]夏華鑫，劉梅，張志敏.丹參水溶性成分體外抗氧化活性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（5）：1086-1087.

（收稿日期：2014-02-12）endprint

1.2材料云厚樸藥材購(gòu)于昆明菊花村中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為木蘭科植物滇緬厚樸（MagnoliarostrataW.W.Smith）的干燥干皮；麗江產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于麗江，會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參購(gòu)于會(huì)澤，兩個(gè)產(chǎn)地的大紫丹參經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定為甘西鼠尾草（SalviaprzewalskiiMaxim.var.mandarinorum（Diels）Stibal）的干燥根。

DPPH·（BR.）（上海凱洋生物技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇（AR.）（天津大茂化學(xué)試劑廠）；厚樸酚對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110729-200411）；蘆?。ㄗ灾疲?/p>

2方法與結(jié)果

2.1云厚樸提取物的制備及含量測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取厚樸酚對(duì)照品3.0mg，置50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解，定容，得濃度為60μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取厚樸酚對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于10mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，在293nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.03414c+0.01765（R2=0.9996）。

2.1.2云厚樸提取物的制備云厚樸SFE-CO2萃取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩備用。按萃取壓力30MPa，萃取溫度45℃，分離壓力7MPa，分離溫度35℃，85%乙醇為夾帶劑，CO2為20L/h，提取時(shí)間2.5h條件下進(jìn)行萃取[6]。萃取液稀釋3倍，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算，得出該萃取液的總酚含量為46μg/mL。

云厚樸乙醇提取物的制備：取云厚樸藥材適量，粉碎過(guò)10目篩，加80%乙醇加熱回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為10倍量，8倍量。合并濾液，回收乙醇，氯仿萃取，旋干，無(wú)水乙醇定容[7]，測(cè)定吸光度，得出該提取液的總酚含量為49μg/mL。

2.2大紫丹參水提取物的制備取大紫丹參（麗江產(chǎn)、會(huì)澤產(chǎn)）適量，粉碎過(guò)40目篩，加蒸餾水回流提取2次，提取時(shí)間依次為1.5、1h，溶媒用量依次為15倍量、20倍量。合并濾液，得大紫丹參水提取液。

2.3DPPH·溶液的制備精密稱取DPPH·26.1mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度261μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.4蘆丁溶液的制備精密稱取蘆丁4.7mg，無(wú)水乙醇為溶劑，超聲溶解后，定容至100mL，配制成濃度47μg/mL的儲(chǔ)備液，密封于冰箱存放，用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋。

2.5波長(zhǎng)-吸光度之間的關(guān)系掃描DPPH·無(wú)水乙醇溶液，考察其紫外吸收情況，測(cè)定結(jié)果顯示，在無(wú)水乙醇介質(zhì)中，DPPH·的最大吸收在516nm附近，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為516nm。

2.6DPPH·溶液顯色穩(wěn)定性考察精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)放置1h內(nèi)，DPPH·溶液吸光度基本不變。

精密吸取DPPH·溶液1.0mL置10mL量瓶中，加入樣品，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置0.5、1、1.5、2h，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)呈線性降低，但30min后，吸光度的變化已經(jīng)很小，故確定反應(yīng)30min后，迅速測(cè)定吸光度，保證在5min內(nèi)測(cè)完。

2.7DPPH·溶液濃度-吸光度之間的關(guān)系精確吸取DPPH·溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置30s后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在516nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，DPPH·濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得出線性方程為A=0.5825c-0.0023（R2=0.9991）。說(shuō)明DPPH·濃度與吸光度之間有線性關(guān)系，可據(jù)此了解加入樣品反應(yīng)后剩余DPPH·的含量。

2.8測(cè)定方法精密吸取1mLDPPH·溶液，加入一定量的提取液，定容至10mL，放置30min，測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，取平均值計(jì)算。以蘆丁溶液的抗氧化實(shí)驗(yàn)與提取液進(jìn)行比較，以下式計(jì)算清除率：

清除率%=（1-AiA0）×100%

A0：1mLDPPH·溶液定容為10mL的吸光度平均值

Ai：1mLDPPH·溶液加入提取液定容為10mL的吸光度平均值

清除率越大，抗氧化活性越高。將清除50%DPPH·所需樣品量定義為C50，C50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

2.9測(cè)定結(jié)果按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，云厚樸SFE-CO2萃取液、云厚樸乙醇提取液、蘆丁溶液清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1云厚樸SFE-CO2萃取液、乙醇提取液、

蘆丁溶液清除DPPH·曲線

由圖計(jì)算出：C50（云厚樸SFE-CO2萃取液）=4.83μg/mL，C50（云厚樸乙醇提取液）=4.17μg/mL，C50（蘆?。?4.70μg/mL。

按2.8項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定，麗江產(chǎn)大紫丹參、會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2大紫丹參（麗江、會(huì)澤）水提取液清除DPPH·曲線

由圖可見，尚未達(dá)到C50時(shí)，曲線就趨于平緩。

3小結(jié)與討論

云厚樸SFE-CO2萃取液清除DPPH·的作用與蘆丁相當(dāng)，云厚樸乙醇提取液清除DPPH·的作用強(qiáng)于SFE-CO2提取液，可能是由于乙醇提取液總酚含量較高。酚類化合物抗氧化的活性，主要是由于它們的還原特性，這種還原特性在中性自由基消除單線態(tài)和三線態(tài)氧或是分解過(guò)氧化物中具有重要作用。厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的作用機(jī)理已有初步研究[3]，但云厚樸提取液的清除機(jī)理與純品溶液是否一致，其機(jī)理如何尚有待進(jìn)一步研究。

大紫丹參水提取液清除DPPH·的作用較弱，還沒有達(dá)到C50，曲線就趨于平緩。麗江產(chǎn)大紫丹參與會(huì)澤產(chǎn)大紫丹參清除DPPH·的作用沒有明顯區(qū)別。丹參及其制劑治療心腦血管疾病的作用與其提取物具有抗氧化活性有關(guān)，通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生從而保護(hù)心臟免受傷害[8]。夏華鑫等研究認(rèn)為丹參水提取液中，丹酚酸B的抗氧化作用最強(qiáng)，丹酚酸B可能是丹參通過(guò)清除氧自由基治療心血管疾病的重要活性成分[9]。大紫丹參的抗氧化活性有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[7]鄧義德，劉海周，曹瑋娟，等.云厚樸兩種提取方法的比較研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（2）：32-38.

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[9]夏華鑫，劉梅，張志敏.丹參水溶性成分體外抗氧化活性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（5）：1086-1087.

（收稿日期：2014-02-12）endprint