大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶的篩選

孫文洪 陳炳豪 朱麗梨 黃國(guó)賢 謝映紅 黃雪瓊

隨著第3代頭孢菌素如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶和單環(huán)酰胺類(lèi)抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥的革蘭陰性菌不斷增加，造成治療上的困難。目前導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要菌屬仍為革蘭陰性菌。革蘭陰性桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，其中以超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）為主，它位于質(zhì)粒上，可由質(zhì)粒在相同或不同菌種間水平傳播；而AmpCβ-內(nèi)酰胺酶主要是染色體介導(dǎo)的，但近年來(lái)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶也陸續(xù)在世界各地發(fā)現(xiàn)，且多見(jiàn)于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。為調(diào)查廣州番禺區(qū)中心醫(yī)院兩種酶的產(chǎn)出情況，本研究在367株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中篩選β-內(nèi)酰胺酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 367株無(wú)重復(fù)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌從本院2013年1月～2013年6月的各種臨床標(biāo)本中分離得到，其中大腸埃希菌156株，肺炎克雷伯菌211株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 MH培養(yǎng)基 Oxiod產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏紙片 頭孢泊肟（Cefpodoxime，CPD）、頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、頭孢曲松（Ceftriaxone Sodium，CRO）、頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium，CTX)、頭孢西丁(Cefoxitin，F(xiàn)OX)、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/ Clavulanic acid，CLA）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CLA）、頭孢哌酮/舒巴坦（Sulbactam，SCF）、亞胺培南（Imipenem，IPM）、復(fù)方磺胺甲基異惡唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)均為Oxoid產(chǎn)品。

1.1.4 微生物鑒定系統(tǒng) 采用Compact60系統(tǒng)（BioMé rieux，法國(guó)）進(jìn)行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 初篩試驗(yàn) 根據(jù)藥敏紙片結(jié)果，將頭孢泊肟或頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm、頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm、頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm，F(xiàn)OX≤17mm的菌株判定為疑產(chǎn)ESBLs菌株。若FOX>17mm的菌株疑為AmpC+。

1.2.2 ESBL表型確診試驗(yàn)[1]在MH瓊脂平皿上，按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)方法接種待測(cè)菌，并貼上頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸和頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸兩對(duì)紙片，經(jīng)35℃溫育16～18h，觀察結(jié)果，兩對(duì)紙片中的任何一對(duì)的抑菌圈如相差5mm以上確認(rèn)為ESBL。同時(shí)以肺炎克雷伯菌ATCC700603株作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 頭孢西丁三相試驗(yàn) 采用Coudron反復(fù)凍融法[4]并作部分改動(dòng)。挑取過(guò)夜培養(yǎng)的受試菌落數(shù)個(gè)，加入30mL胰蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃180r/min振搖12～16h。－80℃及37℃反復(fù)凍融菌液5次，加入0.1mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液1mL，振蕩混勻，離心提取酶粗制品。在MH瓊脂平皿上按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)方法接種大腸埃希菌ATCC25922，在平皿中央貼一FOX紙片，用無(wú)菌刀片在瓊脂表面離FOX紙片邊緣5mm處放射狀切一裂縫，在裂縫里加入25μL粗提物，35℃孵育16～18h后，觀察抑菌圈的形狀，如裂縫與抑菌圈交接處出現(xiàn)細(xì)菌擴(kuò)大生長(zhǎng)， 而含氯唑西林的切槽無(wú)變化，說(shuō)明裂縫里的粗提物使頭孢西丁失活，氯唑西林抑制AmpC酶活性，為AmpC酶陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 β-內(nèi)酰胺酶檢出率 全部實(shí)驗(yàn)菌株367株，115株產(chǎn)ESBLs，總陽(yáng)性率為31.3%，其中大腸埃希菌156株，陽(yáng)性43株（27.6%）；肺炎克雷伯菌 211株，陽(yáng)性 72株（34.1%）。17株產(chǎn)AmpC酶，總陽(yáng)性率為4.6%，其中大腸埃希菌陽(yáng)性7株（4.5%）；肺炎克雷伯菌陽(yáng)性10株（4.7%）。

2.2 藥物敏感性檢測(cè) 所檢測(cè)的菌株對(duì)亞胺培南全部敏感，產(chǎn)酶株對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星敏感性由40%～60%不等；產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)頭孢西丁也較敏感，在三代頭孢菌素中，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性較好；產(chǎn)AmpC酶菌株對(duì)頭孢西丁及三代頭孢菌素的耐藥性明顯（見(jiàn)表1）。

3 討論

ESBLs主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為其代表菌種。自1983年歐洲首次發(fā)現(xiàn)ESBLs以來(lái)，世界各地均有產(chǎn)ESBLs菌感染。新型超廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素廣泛應(yīng)用所產(chǎn)生的選擇壓力是導(dǎo)致ESBLs產(chǎn)酶菌發(fā)生的主要原因[1-2]，因此臨床上應(yīng)該嚴(yán)格限制該類(lèi)藥物作為常規(guī)經(jīng)驗(yàn)治療，以減輕抗生素的選擇壓力，防治產(chǎn)ESBLs菌株的產(chǎn)生和流行，可以選用如β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、頭霉素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)等作為替代品，可有效地減少了ESBLs產(chǎn)酶菌的臨床分離率[3]。阿米卡星系氨基糖甙類(lèi)抗生素，也可用于治療產(chǎn)ESBLs菌引起的感染，但對(duì)產(chǎn)ESBLs菌的耐藥率也較高，一般認(rèn)為是編碼產(chǎn)生ESBLs的質(zhì)粒常攜帶著對(duì)這些抗生素耐藥的基因。因此，在選擇阿米卡星治療產(chǎn)ESBLs菌引起的感染時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果進(jìn)行[4]。另外，由于不產(chǎn)ESBLs株對(duì)各種抗生素的敏感性均高于產(chǎn)ESBLs株，因此相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該進(jìn)行ESBLs的常規(guī)檢測(cè)并及時(shí)報(bào)告，這對(duì)于指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物，提高療效具有顯著意義。

表1 367株大腸埃希菌和肺炎克雷白桿菌藥敏結(jié)果

ESBLs產(chǎn)酶菌為15%，其中又多見(jiàn)于腸桿菌科細(xì)菌。在腸桿菌科細(xì)菌中以肺炎克雷伯菌最為常見(jiàn)，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌占產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌的16.9%～75.0%，其次產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌是大腸埃希菌[5-8]。各個(gè)國(guó)家和地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率明顯不同，這與該地區(qū)抗生素使用水平和細(xì)菌培養(yǎng)耐藥性監(jiān)測(cè)相關(guān)，日本、荷蘭等國(guó)家產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率很低，而法國(guó)、印度等國(guó)家產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率很高，可有高達(dá)50%以上的克雷伯菌屬的菌株產(chǎn)生ESBLs，而且具有較嚴(yán)重的耐藥性[9]。本院大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率27.6%，肺炎克雷伯菌中為34.1%，處于較低水平，這與本單位對(duì)抗菌藥物管理及耐藥性監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展相關(guān)。

AmpC酶是另一大類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，它主要由腸桿菌屬、弗勞地枸櫞酸菌、摩根摩根菌、黏質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌產(chǎn)生的染色體介導(dǎo)的AmpC酶，以及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，它主要位于大腸埃希菌、克雷白桿菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌中。編碼AmpC酶的質(zhì)粒與編碼ESBLs的質(zhì)粒一樣，可同時(shí)攜帶氨基糖甙類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)等的抗藥性基因。本研究的17株陽(yáng)性株，除了對(duì)頭霉素和三代頭孢菌素耐藥外，對(duì)氨基糖甙類(lèi)和磺胺類(lèi)也有不同程度的耐藥。另外AmpC酶的特點(diǎn)之一是不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸抑制。因此在治療可疑產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌的感染時(shí)，更應(yīng)考慮選擇合適的抗生素，碳青霉烯類(lèi)抗生素和第四代頭孢菌素如頭孢吡肟可以作為產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌有效的抗生素[1-2]。

于產(chǎn)AmpC的菌株的檢測(cè)，NCCLS尚未出臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)[10]，臨床實(shí)驗(yàn)室通常只能根據(jù)耐藥表型（如對(duì)第二、三代頭孢菌素耐藥，而雙紙片協(xié)同試驗(yàn)陰性，對(duì)第四代頭孢菌素敏感等）綜合判斷推測(cè)。藥敏試驗(yàn)中需包含頭霉素類(lèi)和含酶抑制劑的復(fù)合制劑是許多學(xué)者的共識(shí)。在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，由于C類(lèi)酶水解頭孢西丁，Coudron等提出采用酶提取物三維試驗(yàn)法檢測(cè)AmpC酶，但此法常規(guī)操作較為困難，因此有必要研究適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的、操作快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)AmpC酶的方法。

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