雙甲五靈膠囊抑制大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化的研究

羅超，王平，徐貴森，沈才飛

（1.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院急診科，成都 610083；2.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610083）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，其發(fā)病與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)，病理學(xué)改變與酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）類似［1，2］。NAFLD 疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）和非酒精性脂肪性肝硬化3種主要類型，其中NASH是NAFLD進(jìn)展的重要中間階段［3，4］。

非酒精性脂肪性肝纖維化是NASH進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)階段，也是其進(jìn)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)和限速步驟。因此，探尋有效抑制NASH肝纖維化的措施是NASH治療的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，中醫(yī)藥抗肝纖維化治療研究已取得較多進(jìn)展，部分已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，如扶正化瘀319膠囊、復(fù)方861沖劑、復(fù)方鱉甲軟肝片等［5］。雙甲五靈膠囊是國內(nèi)自主研發(fā)的一種抗肝纖維化治療的中成藥，其有效性已在長期臨床實踐中得到證實［6］。在本研究中，筆者利用大鼠模型探討雙甲五靈膠囊抑制NASH進(jìn)展及抗纖維化作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

健康雄性成年SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由華西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。雙甲五靈膠囊購自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科（其主要成分為柴胡、五味子、丹參、黃芪、靈芝、鱉甲、穿山甲等9味中藥）。

1.2 NASH大鼠模型的構(gòu)建

以每天25g/只 高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建NASH大鼠模型，其余大鼠以普通飼料補足，自由飲水。高脂飼料配方：豬油10%，膽固醇2%，基礎(chǔ)飼料88%［7］。

1.3 動物分組及給藥

將40只SD大鼠隨機分為3組：1）正常大鼠對照組，10只，以正常飼料喂養(yǎng)；2）空白治療模型組，15只，以高脂飼料喂養(yǎng)，不做其他處理；3）雙甲五靈治療組，15只，以高脂飼料喂養(yǎng)4w之后，同時喂養(yǎng)雙甲五靈膠囊8w（平均2粒/d·只），實驗共持續(xù)12w。期間大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)于（20±2）℃明暗各12h的清潔級動物實驗室。實驗結(jié)束前夜禁食，麻醉狀態(tài)下處死大鼠，稱取大鼠體質(zhì)量、肝濕重，常規(guī)制作血清標(biāo)本及肝臟標(biāo)本，保存于-80℃冰箱。

1.4 血清肝功能指標(biāo)及肝組織TG含量檢測

以日立SBA-300型全自動生化分析儀測量血清ALT、AST、TBIL、ALP及肝組織TG含量。

1.5 肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的測定

采用放射免疫法測定血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ膠原（Ⅳ-C）和Ⅲ型前膠原（PCⅢ），操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 病理學(xué)診斷

肝組織切片后以天狼星紅－苦味酸染色，光鏡下觀察大鼠肝組織膠原沉積情況，并以半定量計分系統(tǒng)（SSS）判斷肝組織炎癥活動度及纖維增生水平［8］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行studentt檢驗或ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙甲五靈膠囊治療對大鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝TG含量等指標(biāo)的影響

與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝TG含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），符合脂肪肝表現(xiàn)；與空白治療模型組相比，雙甲五靈治療組大鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝TG含量則明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 大鼠體質(zhì)量、肝濕重、肝TG含量等指標(biāo)比較

2.2 雙甲五靈膠囊治療對大鼠肝功能指標(biāo)的影響

與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL及ALP均有顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而造模大鼠在給予雙甲五靈膠囊治療后，其4項血清學(xué)指標(biāo)均有顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 肝功能指標(biāo)比較

2.3 肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的變化

雙甲五靈膠囊治療對大鼠肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的影響結(jié)果顯示：與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)HA、LN、Ⅳ-C及PCⅢ均有顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但在給予雙甲五靈膠囊治療的造模大鼠中，肝纖維化血清學(xué)4項指標(biāo)均有顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

表3 肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)比較

2.4 肝纖維化病理學(xué)指標(biāo)

為了進(jìn)一步在病理學(xué)上明確雙甲五靈膠囊治療對NASH大鼠肝纖維化的抑制作用，筆者在實驗終點取所有大鼠肝臟組織并以天狼星紅－苦味酸染色法觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示：與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，存在大量纖維結(jié)締組織增生；與空白治療模型組相比，雙甲五靈治療組肝組織纖維增生程度顯著減輕（見圖1）。根據(jù)SSS計分，雙甲五靈治療組大鼠炎癥活動度及纖維化程度在統(tǒng)計學(xué)上也顯著低于空白治療模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但較正常大鼠對照組，其炎癥活動度及纖維化程度SSS計分仍較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表4）。

圖1 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化（天狼星紅－苦味酸染色法）

表4 炎癥活動度及纖維化程度SSS計分的比較

3 討論

隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢，NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國家主要的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率為10%～30%，其中10%～20%為NASH，后者10年內(nèi)發(fā)生肝硬化的概率高達(dá)25%。隨著人民生活富裕程度的提高，我國肥胖人群愈來愈龐大。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在肥胖人群中，NAFLD發(fā)病率在50%以上。因此，NAFLD的防治已成為我國一個重大公共健康問題［9］。NASH是NAFLD發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，若不加控制，其將向肝纖維化及肝硬化發(fā)展。因此，控制NASH患者的肝纖維化過程尤為重要。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用活血化瘀原理治療肝硬化已經(jīng)取得了較好的效果，提示某些中藥成份具有抗纖維化作用，如黃芪、丹參等［10，11］。臨床研究表明，長期使用活血化瘀藥物，可以有效阻止肝纖維化的進(jìn)展。雙甲五靈膠囊是在五靈丸活血化瘀基礎(chǔ)上輔以軟肝散結(jié)之中藥而成，其主要成份包括柴胡、黃芪、丹參、靈芝、五味子、鱉甲、穿山甲等，實驗室及多年臨床實踐表明，雙甲五靈膠囊是一種有效的抗肝纖維化的中成藥物［6，12，13］。

在本研究中，筆者初步探討了雙甲五靈膠囊對NASH大鼠肝纖維化進(jìn)程的抑制作用，結(jié)果顯示：雙甲五靈膠囊可以在大體、肝功能指標(biāo)、肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)、肝纖維化病理學(xué)指標(biāo)如炎癥活動度及纖維化程度等多個層次改善NASH大鼠肝纖維化的進(jìn)程。這一結(jié)果提示：雙甲五靈膠囊對肝纖維化的抑制作用不僅僅局限于病毒性肝炎由于炎癥壞死所致的肝纖維化，其也可以應(yīng)用于NASH由于游離脂肪酸等有毒物質(zhì)導(dǎo)致的肝纖維化。雖然筆者的研究顯示雙甲五靈膠囊并不能完全抑制NASH的肝纖維化進(jìn)程，但若聯(lián)合應(yīng)用飲食治療、運動治療、行為修正治療或其他藥物治療等綜合措施，可能會取得更好的治療效果。雙甲五靈膠囊抑制NASH大鼠肝纖維化進(jìn)程的機制目前尚不明確，筆者下一步擬在雙甲五靈膠囊對NASH大鼠肝星狀細(xì)胞活化、膠原蛋白的生成與降解平衡、過氧化物清除及氧化應(yīng)激損傷等多個方面進(jìn)行探討，以期能從循證醫(yī)學(xué)的角度證實雙甲五靈膠囊在NASH治療中的作用，為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

［1］中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（5）：641-644.

［2］Patell R，Dosi R，Joshi H，etal.Non-Alcoholic Fatty Liver Disease（NAFLD）in Obesity［J］.J Clin Diagn Res，2014，8（1）：62-66.

［3］Schuppan D，Schattenberg JM.Non-alcoholic steatohepatitis：pathogenesis and novel therapeutic approaches ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2013，28 （11）：68-76.

［4］Bohinc BN，Diehl AM.Mechanisms of disease progression in NASH：new paradigms［J］.Clin Liver Dis，2012，16（3）：549-565.

［5］Gong Y.Identifying the targets for treatment of liver fibrosis and hepatocellular carcinoma from both Western medicine and Chinese medicine［J］.Chin J Integr Med，2012，18（4）：245-249.

［6］謝玉梅，聶青和，康文臻，等.中藥雙甲五靈沖劑對免疫性肝纖維化大鼠抗肝纖維化的分子機制研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（2）：154-158.

［7］徐輝，王旭霞，聞勤生，等.甲氰咪胍在非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展過程中對肝纖維化的影響［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，15（2）：109-112.

［8］曾民德，王泰齡，王寶恩.肝纖維化診斷及療效評估共識［J］.肝臟，2002，7（2）：3-4.

［9］Xiao J，Guo R，F(xiàn)ung ML，etal.Therapeutic approaches to non-alcoholic fatty liver disease：past achievements and future challenges［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2013，12（2）：125-135.

［10］Shi KQ，F(xiàn)an YC，Liu WY，etal.Traditional Chinese medicines benefit to nonalcoholic fatty liver disease：a systematic review and meta-analysis［J］.Mol Biol Rep，2012，39 （10）：9715-9722.

［11］Dong H，Lu FE，Zhao L.Chinese herbal medicine in the treatment of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Chin J Integr Med，2012，18（2）：152-160.

［12］許佳平，白憲光.雙甲五靈膠囊治療肝纖維化的臨床研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2002，10（3）：159-161.

［13］張巖，李艷紅，謝玉梅，等.拉米夫定聯(lián)合雙甲五靈膠囊的抗肝纖維化作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，14（6）：330-331.