羅格列酮逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用及機制

朱紅霞 王保芳 牛保華

Burkitt淋巴瘤是一種比較少見的淋巴造血組織腫瘤，在歐美占兒童淋巴瘤的30%～50%，而散發(fā)型Burkitt淋巴瘤在全世界各地均有發(fā)生[1]。在Burkitt淋巴瘤的治療方面，盡管高強度，化療方案的改進使Burkitt淋巴瘤治療有了很大的提高，新的化療藥物和治療方案仍有待發(fā)現(xiàn)。最近研究認為噻唑烷二酮類(thiazolidinedione，TZD)化合物為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)配體，可通過激活PPAR-γ發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤增殖和血管生成等作用[2]，但尚未見其對人Burkitt淋巴瘤細胞系作用的報道。本研究旨在研究羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）對人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細胞株增殖和凋亡的影響，并探討其逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤耐藥的作用及機制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人Burkitt淋巴瘤raji細胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）購自葛蘭素史克公司。UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑購自美國Sigma公司；β-actin，P-gp和MRP抗體均購自美國Santa Cruz 。辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG(二抗)和堿性磷酸酶顯色試劑盒購于北京中山生物技術(shù)有限公司。RGZ溶于RPMI 1640培養(yǎng)基制成100mmol/L的母液，過濾除菌后-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和耐藥細胞株的建立 raji細胞接種于含10%胎牛血清體積分數(shù)的RPMI 1640培養(yǎng)液(pH值7.2～7.4，含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)。于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

采用逐步間歇藥物濃度遞增法建立紫杉醇耐藥細胞株，歷時172d，藥物濃度從5.0nmol/L 開始逐漸加量，最終獲得了一株能在25nmol/L的TAX含藥培養(yǎng)液穩(wěn)定生長的raji細胞耐藥細胞株，命名為raji/TAX25。該細胞株能在25nmol/L的TAX含藥培養(yǎng)液穩(wěn)定生長，持續(xù)增殖，對數(shù)生長。

1.2.2 細胞計數(shù)法檢測RGZ對各組Raj i細胞生長的抑制作用 將細胞分為4組：未加藥的空白對照組，2RGZ組，25nmol/L TAX組及 RGZ+25nmol/L TAX組。取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度105個細胞/mL接種于24孔板。加入RGZ終濃度為50μmol/L的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，設(shè)陰性對照和空白對照，每組均設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。結(jié)束培養(yǎng)進行細胞計數(shù)。細胞生長抑制率＝(對照組細胞數(shù)-給藥組細胞數(shù))/對照組細胞數(shù)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞 收集50μmol/LRGZ作用 48h后的各組raji細胞，每組細胞數(shù)至少1×106個細胞，輕輕吹打制備單細胞懸液細胞。懸液細胞移入1.5mL離心管，4℃，500g，離心5min。小心移去上清液，冰預(yù)冷PBS洗細胞2次。上流式細胞儀雙染檢測凋亡進行參數(shù)獲取和資料分析，計算細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白印跡法檢測RGZ對raji細胞P-gp和MRP蛋白表達的影響 收集50μmol/L RGZ作用 48h后的各組raji細胞，提取細胞總蛋白。總蛋白濃度經(jīng)Bio-Rad測定，SDSPAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，熒光顯色，沖洗。掃描蛋白印跡膠片后觀察結(jié)果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統(tǒng)（4.02版本）分析條帶影像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12和SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。MTT結(jié)果采用兩因素方差分析，RT-PCR結(jié)果采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥株raji/TAX25的建立及RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 raji和raji/TAX25細胞增殖速度接近，倍增時間分別為73.4h和74.8h，表明在產(chǎn)生耐藥性后細胞增殖未受到明顯抑制。RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，不同組間細胞增值率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.273，P＜0.01）（見圖 1）。

圖1 RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.2 流式細胞儀分析細胞凋亡率 空白對照組的raji和紫杉醇耐藥的raji/TAX25細胞的凋亡率較低，經(jīng)10μmol/LRGZ作用48h，細胞凋亡率分別增加至(7.07±2.95)和(18.43±5.58)。與對照組(1.32±1.11)和(2.51±1.73)相比，不同時間組間細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明RGZ對raji細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)可以增加紫杉醇的誘導(dǎo)凋亡作用(F=7.301，P＜0.01)（見圖2）。

圖2 RGZ對各組raji細胞凋亡的影響

2.3 Western蛋白印跡法檢測各細胞P-gp和MRP蛋白表達的變化 raji/TAX25細胞P-gp的表達（0.488±0.122）明顯高于對照組（0.146±0.074）和 RGZ組（0.074±0.086）細胞，經(jīng)10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.198±0.114），不同組間細胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.787，P＜0.01)。raji/TAX25細胞MRP的表達（0.362±0.109）明顯高于對照組（0.09±0.094）和 RGZ組細胞（0.076±0.083），經(jīng) 10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.149±0.089），不同組間細胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.218，P＜0.05)。RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用與下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白P-gp和MRP的表達密切相關(guān)（見圖3）。

3 討論

圖3 RGZ對各組raji細胞P-gp和MRP蛋白表達的影響

PPAR-γ是由配體激活的家族，屬II型核受體超家族成員，參與脂肪細胞形成、分化、胰島素敏感、調(diào)控細胞周期、抑制炎癥反應(yīng)等方面生理調(diào)節(jié)作用[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ與多種腫瘤關(guān)系密切，在多種腫瘤組織中均有過度表達，對人類腫瘤細胞的增殖及凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。RGZ是PPAR-γ合成激動劑。是臨床治療2型糖尿病的主要藥物之一，RGZ是生物利用度最高、藥效最強且其毒副作用相對較小的一種TZDs類藥物[5]。本研究證實，RGZ對人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細胞株raji/TAX25細胞有顯著的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，提示RGZ具有逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用。

臨床上腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生腫瘤細胞多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)。MDR是指腫瘤細胞在針對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時也對結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的其他類型抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥[6]。因而研究MDR產(chǎn)生的機制并尋求有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑及逆轉(zhuǎn)措施來克服腫瘤臨床耐藥，提高化療效果的重要手段已成為國內(nèi)外的研究熱點。為此本實驗觀察了RGZ對人Burkitt淋巴瘤raji細胞凋亡的影響：流式細胞儀可發(fā)現(xiàn)RGZ作用后raji和raji/TAX25細胞的凋亡率高于對照組和耐藥組，進一步證明RGZ可有效逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用。

MDR分為兩種表型：天然性耐藥和獲得性耐藥。天然性耐藥是指首次使用化療藥物腫瘤細胞產(chǎn)生的耐藥，而獲得性耐藥則是指在化療過程中腫瘤細胞產(chǎn)生的耐藥[7]。MDR的機制十分復(fù)雜，目前認為MDR是多種機制共同作用的結(jié)果。MDR產(chǎn)生的分子機制主要包括：跨膜蛋白增加藥物轉(zhuǎn)運和外排、抗細胞凋亡信號增強、酶系統(tǒng)活性增強等，其中跨膜蛋白增加藥物轉(zhuǎn)運和外排最為重要，因而研究的也最多?？缒さ鞍字饕≒-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)，此類蛋白將抗腫瘤藥物從腫瘤細胞中泵出，從而減少其在細胞中聚集而起作用[8-9]。為探討RGZ逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的分子機制，我們觀察了RGZ作用后細胞中耐藥基因P-gp和MRP表達的變化。結(jié)果顯示，raji/TAX25組P-gp和MRP表達明顯高于對照組，RGZ作用于后raji/TAX25細胞P-gp和MRP表達的下調(diào)，提示RGZ逆轉(zhuǎn)Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的分子機制是通過抑制P-gp和MRP表達來起作用的。

本研究結(jié)果認為RGZ能夠抑制人Burkitt淋巴瘤raji細胞的生長，并能誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。從這一結(jié)論可以看出，RGZ可望成為臨床上治療Burkitt淋巴瘤的有效藥物或輔助用藥。但其作用途徑和機制，尚需進一步研究。另外，應(yīng)通過體內(nèi)研究包括動物實驗及臨床研究來進一步探討RGZ對Burkitt淋巴瘤的治療作用。

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