海藻糖和氨基酸之間相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬

白 姝 常 穎 劉小娟 劉夫鋒，*

(1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072;2天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300072)

1 引言

海藻糖是自然界生物體普遍存在的一種非還原性二糖，它是由兩分子吡喃環(huán)葡萄糖通過α，α-1，1糖苷鍵連接形成，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定.1，2海藻糖具有不同于其它雙糖的獨(dú)特而卓越的生物學(xué)保護(hù)特性，其能夠在極端惡劣(高溫、極端pH、高滲透壓和干燥等)的條件下有效地保護(hù)生物大分子結(jié)構(gòu)不被破壞，從而維持生物體的生命過程.3-6因此，海藻糖常作為蛋白質(zhì)藥物、酶等生物大分子的高效穩(wěn)定劑.7-9此外，海藻糖還可以抑制折疊中間體的聚集沉淀從而作為蛋白質(zhì)復(fù)性添加劑用于蛋白質(zhì)的復(fù)性領(lǐng)域.10

雖然海藻糖已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊和聚集的研究領(lǐng)域，11，12但關(guān)于海藻糖與生物大分子之間的相互作用機(jī)理尚存在很多爭(zhēng)議.目前主要有以下三種假說來解釋海藻糖與生物大分子之間的作用機(jī)制:玻璃態(tài)假說，水替代假說和優(yōu)先排阻假說.13，14玻璃態(tài)假說認(rèn)為在極端條件下海藻糖易于在蛋白質(zhì)周圍形成玻璃態(tài)，從而起到保護(hù)蛋白質(zhì)不被極端環(huán)境損害.15而水替代假說卻認(rèn)為在惡劣環(huán)境下海藻糖能夠替代蛋白質(zhì)周圍的水分子并和蛋白質(zhì)之間形成大量的氫鍵，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能.16與之相反，優(yōu)先排阻假說卻認(rèn)為蛋白質(zhì)不直接與海藻糖發(fā)生相互作用，而是優(yōu)先與水結(jié)合，從而使海藻糖分子從蛋白質(zhì)的溶劑化層中排阻.因此，相對(duì)溶液主體，蛋白質(zhì)表面水分子增多而海藻糖減少，使得生物大分子周圍的海藻糖濃度比溶液中的低，從而使蛋白質(zhì)優(yōu)先水化，其表面張力增加，化學(xué)勢(shì)升高，是熱力學(xué)不利的過程.進(jìn)一步研究表明，其化學(xué)勢(shì)的增加與蛋白質(zhì)的溶劑暴露區(qū)域成正比.由于變性態(tài)的蛋白質(zhì)所暴露的溶劑面積更大，因此海藻糖分子的加入使變性態(tài)蛋白質(zhì)的化學(xué)勢(shì)升高的程度相比自然狀態(tài)的更大.從而使天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在海藻糖溶液中更穩(wěn)定.優(yōu)先排阻學(xué)說是目前最被大家所接收的一種假說.

為了從原子和分子角度上解析海藻糖穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機(jī)理，本研究選擇常見的20種氨基酸為目標(biāo)分子，利用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬解析海藻糖與20種常見氨基酸之間的相互作用.眾所周知，蛋白質(zhì)都是由20種常見氨基酸通過肽鍵連接起來的.當(dāng)海藻糖與蛋白質(zhì)的殘基發(fā)生相互作用時(shí)，這些殘基的N和C端都與它們相鄰的氨基酸連接.因此，為了與實(shí)際情況類似，本研究將20種常見氨基酸的兩端都用最簡(jiǎn)單的氨基酸——甘氨酸封閉，從而形成三肽分子.但在海藻糖和水分子與氨基酸殘基作用分析過程中，本文僅分析了海藻糖和水與中間殘基氨之間的相互作用.希望如此處理可以使解析出的海藻糖和氨基酸之間的作用機(jī)理更具有代表性.此外，相對(duì)于利用整個(gè)蛋白質(zhì)為目標(biāo)分子，這樣處理還可以排除蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)(如二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu))對(duì)海藻糖和殘基之間作用的影響.本研究首先計(jì)算了海藻糖與水和這些氨基酸之間的接觸數(shù)來衡量海藻糖同極性、疏水性殘基、肽骨架或氨基酸側(cè)鏈之間的相互作用.并根據(jù)模擬數(shù)據(jù)計(jì)算得到了海藻糖與這些氨基酸之間的接觸系數(shù)CTW.最后，計(jì)算了海藻糖分子或水分子同氨基酸殘基間氫鍵鍵能.

2 計(jì)算方法

2.1 體系構(gòu)建

海藻糖分子的三維結(jié)構(gòu)文件從GlycoSciences數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.glycosciences.de/)中獲得，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和三維模型如圖1所示.本研究中使用的海藻糖的力場(chǎng)參數(shù)(包括原子的電荷)選用文獻(xiàn)17中報(bào)道的參數(shù).而所有三肽(GXG，其中X代表常見的20種氨基酸)的初始構(gòu)象均利用SYBYL軟件中的Biopolymer/Build模塊構(gòu)建.

首先將三肽放入一個(gè)立方體盒子(6 nm×6 nm×6 nm)中，然后將10個(gè)海藻糖分子隨機(jī)放入該盒子，并與三肽保持一定的距離.隨后將盒子中加滿水，并去除與三肽或海藻糖重疊的水分子.采用三次能量最小化模擬優(yōu)化該體系:首先，固定三肽和海藻糖分子的結(jié)構(gòu)和位置不變，僅讓水分子的結(jié)構(gòu)和位置發(fā)生變化;其次，僅固定三肽分子的結(jié)構(gòu)和位置，使海藻糖和水分子的結(jié)構(gòu)和位置發(fā)生變化;最后，使所有的分子都可以自由運(yùn)動(dòng).表1所示為三肽在海藻糖溶液中模擬系統(tǒng)的詳細(xì)信息.

圖1 海藻糖結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of trehalose

本研究中海藻糖溶液的濃度為0.07 mol·L-1，海藻糖濃度的選擇主要基于作者早期的研究結(jié)果.18在利用分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬研究海藻糖對(duì)多肽構(gòu)象轉(zhuǎn)換的結(jié)果表明海藻糖溶液濃度對(duì)多肽的構(gòu)象轉(zhuǎn)換影響很大.當(dāng)多肽在0.07 mol·L-1濃度的海藻糖溶液中，海藻糖分子能夠促進(jìn)多肽的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，而在較高濃度的海藻糖溶液中，反而會(huì)抑制多肽的構(gòu)象轉(zhuǎn)換.基于此，本研究中海藻糖溶液的濃度也選擇了0.07 mol·L-1.由于本模擬中盒子體積和海藻糖分子個(gè)數(shù)固定不變，而短肽的體積是變化的，因此盒子中水分子的數(shù)量是不相同的.例如，Gly體系中水分子數(shù)量最多為6989，而Leu和Glu體系中水分子最少為6981.其他體系中水分子的個(gè)數(shù)均介于它們之間.從這些數(shù)據(jù)可以看出，水分子數(shù)量的差別很小，僅約為模擬體系中水分子的0.1%.此外，相對(duì)于三肽的體積來說，盒子體積足夠大.因此，氨基酸與水分子和海藻糖分子之間的接觸數(shù)主要由氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)(如，疏水性和帶電性等)所決定.綜上所述，我們認(rèn)為模擬體系中水分子數(shù)量的微小差別(小于0.1%)對(duì)海藻糖和水分子與氨基酸之間的接觸數(shù)基本沒有影響.

表1 模擬系統(tǒng)的參數(shù)Table 1 Parameters of simulation systems

2.2 體系構(gòu)建

本研究采用GROMACS 4.0.5分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件，19水分子采用SPC模型，20GROMOS 96力場(chǎng)用來描述體系內(nèi)分子之間的勢(shì)能.21范德華作用利用Lenard-Jones函數(shù)來計(jì)算，非鍵截?cái)嗑嚯x設(shè)定為1.4 nm，非鍵作用原子列表每4個(gè)步長(zhǎng)更新一次;采用LINCS算法對(duì)形成有化學(xué)鍵的原子之間的相對(duì)距離進(jìn)行固定.22長(zhǎng)程靜電相互作用利用PME方法進(jìn)行計(jì)算，23格點(diǎn)寬度設(shè)為0.12 nm;采用Verlet蛙跳算法對(duì)每一步的運(yùn)動(dòng)方程進(jìn)行求解，經(jīng)過積分得到新的時(shí)刻各原子的坐標(biāo)，步長(zhǎng)設(shè)為2 fs.在計(jì)算過程中采用周期性邊界條件對(duì)于利用有限的計(jì)算單元模擬溶液系統(tǒng)，消除邊界條件是必要的.所有MD模擬均在等溫等壓系綜下進(jìn)行，溫度為300 K，通過vrescale方法24控制溫度，時(shí)間常數(shù)設(shè)為0.1 ps.壓力為1.01×105Pa，壓力控制采用Berendsen方法，壓力耦合常數(shù)為0.5 ps.所有分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算均在曙光TC2600刀片服務(wù)器(每刀片包括4路4核的AMD Opteron 8347HE CPU和8G內(nèi)存)上完成(Dawning，中國(guó)天津).

2.3 模擬分析

2.3.1 接觸數(shù)

接觸數(shù)是指分子間發(fā)生作用的原子接觸個(gè)數(shù)，該參數(shù)常被用來表征兩分子之間相互作用的強(qiáng)弱.25本研究中分子之間的接觸數(shù)由GROMACS軟件自帶的g_mindist程序完成.當(dāng)兩個(gè)原子間的間距小于0.35 nm時(shí)，才認(rèn)為原子間相互接觸，視作一個(gè)接觸數(shù).

2.3.2 接觸系數(shù)

由于這20種氨基酸含有不同的原子個(gè)數(shù)，因此模擬系統(tǒng)中海藻糖和水分子原子總數(shù)差異較大，因此為了準(zhǔn)確量化每種氨基酸分子同海藻糖或水分子結(jié)合作用的相對(duì)大小，本研究又定義了氨基酸的接觸系數(shù)CTW:

其中，NX-T和NX-W分別代表氨基酸X同海藻糖分子或水分子的原子接觸數(shù).MT代表海藻糖分子的總原子數(shù)，其為31.MW代表水的總原子數(shù).

CTW數(shù)值越大，表明該氨基酸和海藻糖分子的結(jié)合作用更強(qiáng).分子動(dòng)力學(xué)軌跡的顯示分析和構(gòu)象圖均用Visual Molecular Dynamics(VMD)(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)軟件完成.

2.3.3 氫鍵鍵能計(jì)算

氫鍵鍵能的計(jì)算利用GROMACS 4.0.5軟件自帶的g_hbond程序計(jì)算.首先，計(jì)算每種氨基酸同海藻糖或水分子之間的氫鍵距離隨模擬時(shí)間的變動(dòng).然后利用經(jīng)驗(yàn)公式(2)估算出氫鍵鍵能(E):

其中，d(H??A)表示供體上的氫原子和受體原子之間的距離.值得注意的是，通過公式(2)計(jì)算得到的是孤立氫鍵的能量，是僅通過氫鍵供體和受體之間的距離估算的氫鍵鍵能，并不十分精確.也就是說，它們不同于蛋白質(zhì)溶液中實(shí)際的氫鍵能量.但利用該方法計(jì)算氫鍵能量非常簡(jiǎn)單，且已有大量研究證明該方法可以用于表示分子之間的氫鍵強(qiáng)弱.26-28因此本研究也用它來衡量這些氨基酸和水和海藻糖之間形成氫鍵的強(qiáng)弱.

3 結(jié)果與討論

3.1 海藻糖、水和氨基酸整體的接觸數(shù)

首先分別計(jì)算氨基酸-海藻糖以及氨基酸-水之間的接觸數(shù)來表征氨基酸分子與海藻糖和水分子之間的作用力的強(qiáng)弱以及氨基酸的優(yōu)先作用傾向.眾所周知，接觸數(shù)越大，表明分子間的結(jié)合作用越強(qiáng).反之，分子間的結(jié)合作用越弱.圖2所示為海藻糖和水分別與這20種常見氨基酸的接觸數(shù).從圖2可以看出，所有氨基酸和水之間的接觸數(shù)均遠(yuǎn)大于其和海藻糖之間的接觸數(shù).這說明這些氨基酸主要和水分子優(yōu)先結(jié)合，而對(duì)海藻糖分子優(yōu)先排阻.其中，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸與海藻糖之間的接觸數(shù)均為零，即這些氨基酸和海藻糖之間沒有任何直接作用.這主要是因?yàn)檫@些氨基酸的側(cè)鏈均為極性基團(tuán)，它們會(huì)優(yōu)先和水分子作用而對(duì)海藻糖分子排阻.而脯氨酸側(cè)鏈雖然為疏水性基團(tuán)，但是其側(cè)鏈原子與骨架C、N原子共同形成了一個(gè)五元環(huán)，從而產(chǎn)生較大的空間位阻，從而與海藻糖之間沒有直接作用，因此其與海藻糖之間的接觸數(shù)也為零.

圖2 氨基酸與海藻糖和水之間的接觸數(shù)Fig.2 Number of contacts between amino acids and trehalose and water

從圖2可以看出，在20種常見氨基酸中，色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖之間的接觸數(shù)最大，表明它們與海藻糖有較強(qiáng)的相互作用.主要原因是這兩種氨基酸均為非極性氨基酸，且側(cè)鏈均帶有苯環(huán)，從而和海藻糖的六圓環(huán)發(fā)生相互作用.圖3為色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖相互作用的示意圖.從該圖可以看出，色氨酸和苯丙氨酸側(cè)鏈上的苯環(huán)和海藻糖分子的六圓環(huán)平行堆疊(如圖3中橢圓所標(biāo)示)，從而使色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖的作用力較其它氨基酸強(qiáng).另外，雖然這些色氨酸和苯丙氨酸之間的接觸數(shù)遠(yuǎn)大于其它氨基酸，但氨基酸-海藻糖之間的接觸數(shù)也小于這些氨基酸和水分子之間的接觸數(shù).即，這些氨基酸也優(yōu)于和水分子發(fā)生相互作用.

從圖2可以看出，所有氨基酸均與水分子接觸，且與水分子的接觸數(shù)均大于它們與海藻糖之間的接觸數(shù).其主要原因是所有氨基酸均含有極性主鏈―NH―CO―.其中，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸等極性氨基酸，它們和水分子的接觸數(shù)均大于60.在所有氨基酸中，脯氨酸和水分子的接觸數(shù)是最小的，主要原因除了脯氨酸為疏水性氨基酸之外，還與其結(jié)構(gòu)特殊有關(guān).脯氨酸特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其缺少極性基團(tuán)―NH，因此脯氨酸和水分子的接觸數(shù)在20種常見氨基酸中是最小的.

圖3 海藻糖與色氨酸(a)和苯丙氨酸(b)之間直接相互作用示意圖Fig.3 Snapshots of the direct interaction between trehalose and tryptophane(a)and phenylalanine(b)

綜上所述，所有氨基酸與水分子的接觸數(shù)均大于它們和海藻糖分子之間的接觸數(shù).色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖之間的接觸數(shù)遠(yuǎn)大于其他的氨基酸與海藻糖之間的接觸數(shù)，但其與水分子之間的接觸數(shù)也大于其與海藻糖之間的接觸數(shù).此外，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸等極性氨基酸和水分子的接觸數(shù)最多.

3.2 海藻糖和水分別與氨基酸骨架和側(cè)鏈之間的接觸數(shù)

為了進(jìn)一步解析氨基酸的骨架和側(cè)鏈分別與海藻糖和水之間相互作用，我們又分別計(jì)算了20種常見氨基酸的骨架和側(cè)鏈分別與海藻糖和水之間的接觸數(shù)，如圖4和圖5所示.

圖4所示為氨基酸的主鏈和側(cè)鏈與海藻糖之間的接觸數(shù).從圖4可以看出，所有氨基酸骨架和海藻糖的接觸數(shù)均很小，最大不超2個(gè).海藻糖主要和氨基酸的側(cè)鏈接觸.這說明與氨基酸側(cè)鏈相比，其骨架和海藻糖的作用較小.眾所周知，所有氨基酸的骨架原子完全一致，但圖4顯示各氨基酸骨架和海藻糖的接觸數(shù)存在一些差別.這說明這些氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)會(huì)影響它們的骨架和海藻糖的結(jié)合作用.此外，由于甘氨酸無側(cè)鏈，故側(cè)鏈對(duì)應(yīng)的接觸數(shù)為零.酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸無論是骨架還是側(cè)鏈，與海藻糖接觸數(shù)均為零，故其整體與海藻糖沒有任何作用，與圖2結(jié)果相符.

圖4 氨基酸的主鏈和側(cè)鏈與海藻糖之間的接觸數(shù)Fig.4 Number of contacts between backbone and side chain of amino acids and trehalose

在其它氨基酸中，大部分側(cè)鏈和海藻糖的接觸數(shù)都大于其骨架和海藻糖的接觸數(shù)，這說明氨基酸的側(cè)鏈在氨基酸和海藻糖的結(jié)合作用中貢獻(xiàn)較大，是氨基酸和海藻糖的主要作用位點(diǎn).尤其是，色氨酸和苯丙氨酸的側(cè)鏈與海藻糖的接觸數(shù)最大，結(jié)合作用最強(qiáng).這主要是因?yàn)槠鋫?cè)鏈均為非極性基團(tuán)，且?guī)в斜江h(huán)，更易與海藻糖結(jié)合(圖3所示).從圖4可以看出，天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈和海藻糖的接觸數(shù)有較大差異.例如，天冬酰胺的側(cè)鏈和海藻糖的接觸數(shù)為3.25，而谷氨酰胺的側(cè)鏈和海藻糖的接觸數(shù)為10.56.主要原因?yàn)楣劝滨０返膫?cè)鏈比天冬酰胺的側(cè)鏈多一個(gè)亞甲基，從而使谷氨酰胺的側(cè)鏈的疏水性比天冬酰胺高，從而極大提高了側(cè)鏈和海藻糖的親和作用.

綜上所述，側(cè)鏈?zhǔn)前被岷秃Ｔ逄堑闹饕饔梦稽c(diǎn)，而氨基酸的骨架和海藻糖之間的作用卻較弱.尤其是非極性、芳香族氨基酸的側(cè)鏈和海藻糖的作用最強(qiáng).

圖5所示為水分子與氨基酸主鏈和側(cè)鏈之間的接觸數(shù).從圖5可以看出，所有氨基酸骨架和水的接觸數(shù)由于側(cè)鏈類型、空間結(jié)構(gòu)等的不同，略有差異，但最大不超過11.除疏水性氨基酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、胱氨酸、絲氨酸和脯氨酸之外，其余氨基酸側(cè)鏈和水的接觸數(shù)均大于其骨架和水的接觸數(shù).例如，酪氨酸的側(cè)鏈和水分子之間的接觸數(shù)最大，可達(dá)到84.這說明骨架和水的結(jié)合作用對(duì)于氨基酸和水分子之間的作用影響差別不大.相反，對(duì)于大部分氨基酸，側(cè)鏈?zhǔn)前被岷退肿拥闹饕饔梦稽c(diǎn).由于天冬酰胺的側(cè)鏈比谷氨酰胺的側(cè)鏈少一個(gè)亞甲基，從而使其側(cè)鏈的親水性要好于谷氨酰胺的.因此它和水分子的接觸數(shù)(39.68)要稍大于谷氨酰胺的側(cè)鏈和水分子之間接觸數(shù)(32.15).綜上所述，側(cè)鏈?zhǔn)浅耸杷园被嶂獾陌被岷退肿拥闹饕饔梦稽c(diǎn)，比骨架和水分子之間的作用力要強(qiáng).此外，骨架對(duì)側(cè)鏈和海藻糖的結(jié)合作用也有一定影響.

圖5 氨基酸的主鏈和側(cè)鏈與水分子之間的接觸數(shù)Fig.5 Number of contacts between backbone and side chain of amino acids and water

3.3 氨基酸的接觸系數(shù)

考慮到模擬系統(tǒng)中海藻糖和水原子總數(shù)的差異對(duì)接觸數(shù)會(huì)有所影響，進(jìn)一步引入CTW來分析每種氨基酸分別與海藻糖和水分子的結(jié)合傾向.圖6所示為每種氨基酸的接觸系數(shù)CTW.

從圖6可以看出，色氨酸和苯丙氨酸的接觸系數(shù)最大，分別為41和38.其次為谷氨酰胺和半胱氨酸，它們的接觸系數(shù)均大于20.蛋氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸、丙氨酸，甘氨酸和纈氨酸的接觸系數(shù)大于10.酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸因?yàn)槠渑c海藻糖間的接觸數(shù)都為0，故對(duì)應(yīng)的CTW值為零.此處以主鏈的接觸系數(shù)作為比較標(biāo)準(zhǔn)是因?yàn)閮?yōu)先排阻學(xué)說認(rèn)為蛋白質(zhì)的優(yōu)先排阻主要是由蛋白質(zhì)的主鏈所引起的.因此，海藻糖與主鏈接觸數(shù)很少，而水分子與主鏈的接觸數(shù)相對(duì)于各氨基酸基本相同，所以20種常見氨基酸主鏈的接觸系數(shù)的平均值為69.8.基于上述分析，若各氨基酸的接觸系數(shù)小于69.8表明該氨基酸更易于與水分子結(jié)合，而對(duì)海藻糖分子進(jìn)行排阻.從圖6可以看出所有氨基酸對(duì)應(yīng)的接觸系數(shù)均遠(yuǎn)小于69.8，即這些氨基酸均和水分子優(yōu)先結(jié)合，而對(duì)海藻糖優(yōu)先排阻.綜上所述，海藻糖的優(yōu)先排阻主要由氨基酸的主鏈和側(cè)鏈相互作用的結(jié)果.

圖6 氨基酸的接觸系數(shù)(CTW)Fig.6 Contact coefficient(CTW)for each amino acid

基于以上分析，本研究結(jié)果支持優(yōu)先排阻學(xué)說.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在自然狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)的疏水氨基酸會(huì)在疏水相互作用影響下發(fā)生疏水塌縮，而親水性氨基酸側(cè)鏈會(huì)分布在蛋白質(zhì)的表面，因此這些親水性的側(cè)鏈會(huì)優(yōu)先和水分子發(fā)生相互作用，而對(duì)海藻糖優(yōu)先發(fā)生排阻作用.當(dāng)變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)在海藻糖溶液中，這些氨基酸和水分子之間的親合作用均比它們和海藻糖之間的作用更強(qiáng)，即這些氨基酸更易于和水分子發(fā)生相互作用，而排阻海藻糖分子，從而造成蛋白質(zhì)對(duì)海藻糖分子的排阻.當(dāng)然，蛋白質(zhì)在海藻糖溶液中，海藻糖和水與氨基酸之間的相互作用比本研究體系要復(fù)雜.蛋白質(zhì)的序列、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)對(duì)海藻糖和水與氨基酸殘基之間作用有影響.將來在研究海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響過程中，考慮利用二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)稟傾向性受溶劑調(diào)控的分析方法詳細(xì)研究海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響機(jī)制.29此外，由于氨基酸在蛋白質(zhì)分子中的環(huán)境與本文選擇的三肽系統(tǒng)有顯著區(qū)別，為了更真實(shí)地了解海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的影響.作者將在后期研究中開展海藻糖穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機(jī)理.考慮到蛋白質(zhì)分子體系的復(fù)雜性，為了在更大的構(gòu)型空間上取樣，將采用更為有效的構(gòu)象采樣方法——副本交換分子動(dòng)力學(xué)方法來研究海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子機(jī)理.30，31

3.4 氫鍵鍵能

從圖1可以看出，海藻糖含有8個(gè)羥基，因此氫鍵是氨基酸和海藻糖與水分子之間的主要作用力之一，對(duì)氨基酸和海藻糖與水之間的結(jié)合作用具有重大貢獻(xiàn).下面通過計(jì)算海藻糖和水與氨基酸之間整體氫鍵鍵能的平均值來衡量常用20種氨基酸和海藻糖分子間氫鍵作用的強(qiáng)弱(表2).從表2可以看出，所有氨基酸和水分子間的氫鍵鍵能均遠(yuǎn)大于氨基酸和海藻糖間的氫鍵鍵能.例如，所有氨基酸和水分子之間氫鍵鍵能的平均值為24.45 kJ·mol-1，而所有氨基酸和海藻糖分子之間的氫鍵鍵能的平均值僅為6.85 kJ·mol-1.另外，氨基酸同水分子間的氫鍵鍵能最大為酪氨酸和水分子之間的氫鍵，其鍵能為30.76 kJ·mol-1，最小鍵能為賴氨酸和水分子之間的氫鍵，其鍵能為20.75 kJ·mol-1.而氨基酸和海藻糖間的氫鍵鍵能最大的為天冬氨酸和海藻糖分子之間的氫鍵，它們的鍵能僅為12.27 kJ·mol-1.其中，谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸無論是主鏈還是側(cè)鏈，和海藻糖間的氫鍵鍵能均為零，即這些氨基酸和海藻糖之間沒有氫鍵作用，這與圖4的結(jié)果一致.而谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸和水分子之間均發(fā)生氫鍵作用.而帶電氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸和精氨酸)和極性氨基酸(絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸)的主鏈和側(cè)鏈均和水分子有氫鍵.而這些帶電和極性氨基酸的側(cè)鏈和水的氫鍵鍵能大于主鏈和水的氫鍵鍵能.也就是說，這些氨基酸的側(cè)鏈更易與水形成氫鍵，側(cè)鏈上的極性基團(tuán)是氨基酸和水的主要作用位點(diǎn).與之相反，其他氨基酸的側(cè)鏈和水的氫鍵鍵能均小于它們主鏈和水的氫鍵鍵能，也就是說這些氨基酸主要是通過主鏈和水發(fā)生氫鍵作用.因此，氫鍵是氨基酸和水的主要結(jié)合力.此外，水比海藻糖更易形成氫鍵，且極性氨基酸側(cè)鏈的極性基團(tuán)和主鏈?zhǔn)前被岷退闹饕饔梦稽c(diǎn).

表2 氨基酸的主鏈和側(cè)鏈與海藻糖和水之間氫鍵鍵能的平均值Table 2 Average values of energies of hydrogen bonds between each amino acid including its backbones and side chains and trehalose and water molecules

4 結(jié)論

選擇兩端以甘氨酸封閉的三肽作為模型蛋白質(zhì)，利用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬方法考察海藻糖和氨基酸之間的相互作用，以便從原子和分子水平上深入闡釋海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用機(jī)制.結(jié)果表明，相對(duì)于海藻糖分子所有氨基酸均優(yōu)先和水分子結(jié)合.其中，極性帶電氨基酸和水的結(jié)合作用較強(qiáng);而相較于其它氨基酸，非極性芳香氨基酸和海藻糖的結(jié)合作用較強(qiáng)，而氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)瞧渑c海藻糖的主要作用位點(diǎn).氨基酸骨架和海藻糖與水分子的作用均較側(cè)鏈弱，而氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)浅彼?、纈氨酸之外的所有氨基酸和水分子的主要作用位點(diǎn).非極性芳香氨基酸的側(cè)鏈和海藻糖的作用較極性氨基酸側(cè)鏈和海藻糖的作用強(qiáng)，而和水分子的作用卻較極性氨基酸側(cè)鏈和水分子的作用弱;氨基酸和海藻糖和水之間均形成氫鍵，但海藻糖-氨基酸之間的氫鍵弱于氨基酸和水之間的氫鍵，極性氨基酸側(cè)鏈的極性基團(tuán)和主鏈?zhǔn)前被岷退闹饕饔梦稽c(diǎn).其中，谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸和海藻糖間的氫鍵鍵能均為零.綜上所述，僅從氨基酸殘基角度分析，本研究結(jié)果支持海藻糖和蛋白質(zhì)之間的作用機(jī)理為優(yōu)先排阻學(xué)說.但需要進(jìn)一步說明的是，由于本研究中選用的三肽與實(shí)際溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差別較大，在隨后的研究工作中，我們會(huì)繼續(xù)研究蛋白質(zhì)的骨架、側(cè)鏈和整個(gè)蛋白質(zhì)與海藻糖相互作用的機(jī)理，希望基于這些研究可以對(duì)海藻糖穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機(jī)理有新的認(rèn)識(shí).

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