瘦素誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞活化及其作用機(jī)制

李東，黃光龍，曾成林，王亞瑞

（廣東省化州市人民醫(yī)院，廣東 化州 525100 E－mail：254599846＠qq.com）

瘦素（leptin）是白色脂肪組織分泌的調(diào)節(jié)能量代謝的重要激素，通過中樞和外周作用調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪和體重。此外，也可以作用于機(jī)體廣泛分布的瘦素受體，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、造血功能、器官纖維化、骨骼代謝、腫瘤和心血管疾病等病理和生理過程［1］。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，肥胖和糖尿病患者常合并高瘦素血癥，而且在肝纖維化動(dòng)物模型肝臟局部組織瘦素表達(dá)也很高，已有一些研究發(fā)現(xiàn)瘦素可能直接作用于HSC而促進(jìn)其激活［2］，但是其中的分子機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過體外瘦素處理人肝星狀細(xì)胞（模擬機(jī)體高瘦素血癥），觀察研究瘦素對(duì)人肝星狀細(xì)胞的活化及其作用機(jī)制，為臨床防治肝纖維化提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 瘦素購自 Prospec公司（Israel），抗 TGF－β1、SREBP－1c、Ⅰ型膠原、α－SMA抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，DMEM培養(yǎng)基以及特級(jí)胎牛血清（FBS）購自Gibco BRL（USA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HSC細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.3 Western blot測(cè)定蛋白的表達(dá) HSCs細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置30min，12 000r／min離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5h，隨后加入抗TGF－β1、SREBP－1c、Ⅰ型膠原和α－SMA抗體 （1∶1 000），4℃過夜，用TBST洗3次，10分／次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 瘦素可以誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞a－SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)上調(diào) 為了探討高瘦素血癥對(duì)HSCs細(xì)胞的影響，體外用重組瘦素處理HSCs細(xì)胞48h后，與正常對(duì)照組比較，α－SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)顯著升高。α－SMA是肌成纖維細(xì)胞重要的分子標(biāo)志，該結(jié)果提示瘦素可以誘導(dǎo)HSC細(xì)胞活化。而Ⅰ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成分，活化的HSCs細(xì)胞是Ⅰ型膠原的主要來源細(xì)胞（見圖1）。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2.2 瘦素上調(diào)HSCs細(xì)胞TGF－β1的表達(dá) TGF－β1在肝臟纖維化中起著關(guān)鍵性作用，活化的HSCs細(xì)胞可以分泌TGF－β1。為了觀察高瘦素血癥可否影響HSCs細(xì)胞TGF－β1的分泌，本研究結(jié)果顯示，HSCs細(xì)胞在瘦素（100ng／ml）處理48 h后，TGF－β1的表達(dá)顯著上調(diào)（見圖1）。

2.3 瘦素抑制HSCs細(xì)胞SREBP－1c的表達(dá) 未活化HSC類同于脂肪細(xì)胞，而HSCs的激活如同前脂肪細(xì)胞的逆分化。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白－1c（sterol regulatory element binding protein－1c，SREBP－1c）是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［3］。為了探討瘦素對(duì)HSCs細(xì)胞SREBP－1c蛋白表達(dá)的作用，體外培養(yǎng)的HSCs細(xì)胞用不同劑量瘦素孵育48h（見圖2），Western Blot檢測(cè)SREBP－1c蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，瘦素可以劑量依賴地抑制HSCs細(xì)胞SREBP－1c的蛋白表達(dá)。

3 討論

肝纖維化是慢性肝病和各種肝損傷修復(fù)創(chuàng)傷的結(jié)果，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失去平衡的病理過程，也是各種肝病和肝損傷導(dǎo)致肝硬化的最后共同通路［4］。肥胖、糖尿病患者的肝纖維化發(fā)生率比正常人高幾倍，而其血清瘦素水平很高，提示高瘦素血癥與肝纖維化有密切關(guān)系［5］。目前已經(jīng)證實(shí)，HSCs活化和增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，HSCs受各種細(xì)胞因子的激活而轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵［6］。瘦素是由白色脂肪組織分泌的一種肽類激素和細(xì)胞因子，通過瘦素受體（Leptin receptor）作用于中樞下丘腦和外周器官組織，影響機(jī)體能量代謝和與調(diào)節(jié)多個(gè)系統(tǒng)的功能。近年來有研究提示瘦素可能是一種重要的促肝纖維化因子［7］。

圖1 瘦素誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞a－SMA、Ⅰ型膠原和TGF－β1表達(dá)的上調(diào)

100 ng／ml瘦素處理HSCs細(xì)胞48h后，western blot檢測(cè)α－SMA、Collagen I、TGF－β1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果以（±s）表示，n＝5，與對(duì)照組比較，＊＊P ＜0.01100 ng／ml瘦素處理HSCs細(xì)胞48h后，Western blot檢測(cè)SREBP－1c的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果以（±s）表示，n＝5，與對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P ＜0.01

圖2 高糖抑制HSC細(xì)胞SREBP－1c的表達(dá)

瘦素在肝臟纖維化的發(fā)展中有重要作用，瘦素可能主要作用是激活HSCs細(xì)胞促進(jìn)HSC增殖，而參與肝纖維化的發(fā)展。正常生理情況下，肝臟不表達(dá)瘦素，但有其受體的表達(dá)；而在肝纖維化時(shí)，瘦素隨肝纖維化程度的增加而不斷升高［8］。瘦素激活HSCs細(xì)胞而促肝纖維化的作用主要是通過自分泌和旁分泌實(shí)現(xiàn)，然而，其中具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示：瘦素處理HSCs后可以上調(diào)α－SMA、Ⅰ型膠原和TGF－β1表達(dá)，提示瘦素可以激活HSCs而參與肝纖維化；此外，TGF－β1是肝纖維化的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，參與HSCs表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谀z原的肌纖維母細(xì)胞，瘦素可以刺激HSCs分泌TGF－β1增多，進(jìn)一步加重肝纖維化；該結(jié)果提示，瘦素激活HSCs參與肝纖維化可能是通過TGF－β1信號(hào)通路。沒有被激活的HSCs細(xì)胞類同于脂肪細(xì)胞，HSCs的激活類似于前脂肪細(xì)胞的逆分化，SREBP－1c為抑制HSCs活化的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘦素可以抑制HSCs細(xì)胞SREBP－1c的表達(dá)。此研究結(jié)果提示，瘦素激活HSCs細(xì)胞可能與抑制HSCs細(xì)胞SREBP－1c表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，瘦素可以激活人肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，其分子機(jī)制可能與通過激活TGF－β1通路和抑制SREBP－1c通路有關(guān)。進(jìn)一步深入研究瘦素和肝纖維化相互作用的詳細(xì)機(jī)制，對(duì)于防治肥胖、糖尿病相關(guān)的肝纖維化有重要意義，為肝纖維化機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 劉芹，李云，甘立霞，等.瘦素在肝臟中的生理功能及其在肝臟疾病中的作用［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（6）：876－879.

［2］ 黃成，馬陶陶，李浩，等.豹皮樟總黃酮調(diào)控瘦素、TGF－β1對(duì)肝纖維化大鼠的預(yù)防作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（12）：1666－1671.

［3］ 婁瑩瑩，李佃貴，周文平，等.肝復(fù)健方對(duì)瘦素調(diào)控肝纖維化大鼠JAK2／STAT3信號(hào)通路的影響［J］.中醫(yī)雜志，2013，54（9）：781－784.

［4］ 張希順，呂宇航，王玉紅，等.丹紅軟肝膠囊對(duì)肝纖維化患者TGF－β1和瘦素的調(diào)節(jié)作用［J］.西南國防醫(yī)藥，2013，23（4）：358－359.

［5］ 曾斌，張杰，廖愛軍，等.瘦素與SB－431542干預(yù)大鼠肝星狀細(xì)胞及其生物學(xué)活性的改變［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（29）：36－39.

［6］ 呂霞，舒建昌，付景，等.姜黃素對(duì)人肝星狀細(xì)胞株LX－2瘦素和脂聯(lián)素表達(dá)的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（11）：1641－1644.

［7］ 盧鶯燕，王偉，周林福，等.血清瘦素水平在評(píng)估慢性病毒性肝炎肝纖維化程度中的意義［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2013（12）：1150－1152.

［8］ 朱凈，潘亮，許晶，等.瘦素及Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的變化［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32（10）：1224－1225.