榨前分離蘋果皮多糖的鑒定及抗氧化活性研究

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(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

榨前分離蘋果皮多糖的鑒定及抗氧化活性研究

竇姣,郭玉蓉*,薛戰(zhàn)鋒,陳瑋琦,李錦運(yùn),孟永宏

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

蘋果皮,多糖,分離純化,抗氧化活性

多糖又稱多聚糖(polysaccharides),由10個(gè)以上單糖殘基通過糖苷鍵連接而成,是一類廣泛存在于動(dòng)植物、微生物細(xì)胞中的重要的生物大分子物質(zhì)[1]。隨著對(duì)多糖生物活性研究的深入及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,消費(fèi)者對(duì)多糖的需求日趨增加[2-3]。蘋果多糖是植物多糖的重要種類之一,蘋果渣可以作為蘋果多糖來源之一,我國(guó)作為世界的蘋果濃縮汁生產(chǎn)大國(guó),每年都有上百萬噸的蘋果渣資源急需再利用[4]。榨前分離技術(shù)是采用冷破碎設(shè)備在果汁壓榨前實(shí)現(xiàn)果皮、果核、果籽與果肉的分離,從而提高果汁的外觀品質(zhì),方便蘋果皮、肉的分別利用[5]。蘋果果皮是蘋果的重要組成部分,其中多糖含量豐富,是一種有開發(fā)前景的提取多糖的材料。目前,粗多糖中常含有單糖、低聚糖、游離蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì),不但會(huì)影響多糖生物活性,還會(huì)影響多糖的定量、定性分析及結(jié)構(gòu)測(cè)定,因此多糖的分離純化成為多糖研究和利用的重要內(nèi)容之一[6]。另外,多糖的生物活性也是研究的熱點(diǎn)之一,國(guó)內(nèi)外對(duì)蘋果多糖生物活性的研究主要集中在降血脂、抗癌、預(yù)防肥胖和降低膽固醇水平等方面[7],但對(duì)蘋果皮多糖的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)榨前分離蘋果皮中的多糖進(jìn)行提取、分離、純化并進(jìn)一步研究其不同組分的抗氧化活性,旨在對(duì)我國(guó)蘋果皮資源的開發(fā)利用提供一些新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蘋果皮 陜西師范大學(xué)冷破碎制汁生產(chǎn)線提供；透析袋 華美生物工程公司上海分公司；Cellulose DE-52纖維素柱填料、Sephadex G-200 medium凝膠柱填料 北京索萊寶科技有限公司提供；無水乙醇、石油醚、乙醚、NaCl、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三氯乙酸、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸亞鐵銨、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、H2O2均為分析純。

實(shí)驗(yàn)DBS-100部分自動(dòng)收集器、DHL-B電腦橫流泵 上海滬西儀器廠;RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；WFJ2100型分光光度計(jì) 尤尼科儀器有限公司上海分公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器廠；PHS-3C精密PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司；SGW-1自動(dòng)旋光儀 湖北省自動(dòng)化研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榨前分離蘋果皮多糖的提取制備 蘋果皮→55℃干燥→粉碎(過60目篩)→乙醚∶石油醚(1∶4)回流脫脂→超聲輔助提取(120min,料液比1∶40,70℃,超聲功率200W)→95%乙醇沉淀(4℃,靜置過夜)→離心20min(4000r/min)→沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌2次→真空冷凍干燥→蘋果皮粗多糖。

1.2.2 榨前分離蘋果皮多糖的分離純化 蘋果皮多糖的分離：蘋果皮粗多糖→用蒸餾水溶解→過DE-52纖維素柱→不同濃度NaCl溶液梯度洗脫→收集不同組分蘋果皮多糖→濃縮(原體積的1/6)→透析→濃縮→真空冷凍干燥→不同組分蘋果皮多糖半純品。

蘋果皮多糖的純化：蘋果皮多糖半純品→用蒸餾水溶解→過G-200凝膠柱→蒸餾水洗脫→收集不同組分蘋果皮多糖→濃縮(原體積的1/4)→透析→濃縮→真空冷凍干燥→不同組分蘋果皮多糖純品[8]。

1.2.3 不同組分蘋果皮多糖的鑒別反應(yīng)

1.2.3.1 多糖的純度鑒定 將分離純化得到的不同組分多糖純品配制成10mg/mL溶液,以化學(xué)方法進(jìn)行淀粉、多肽、蛋白質(zhì)和氨基酸等雜質(zhì)的檢驗(yàn)。茚三酮反應(yīng)鑒別是否含氨基酸、肽類或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；苯酚-硫酸法鑒定是否為糖類物質(zhì)；三氯化鐵反應(yīng)鑒別是否含酚類物質(zhì)；碘-碘化鉀反應(yīng)鑒別是否含淀粉類雜質(zhì)；硫酸-咔唑法鑒定是否含有糖醛酸[9]。

1.2.3.2 比旋光度的測(cè)定 不同種類的多糖在相同條件下的比旋光度不同,通過測(cè)定不同組分多糖溶液的比旋光度來鑒定分離出的多糖是否是同一多糖[10]。每一組分多糖的比旋光度測(cè)定8次取平均值。

1.2.3.3 不同組分多糖紫外光譜掃描 蛋白質(zhì)、多肽、核酸等物質(zhì)在260～280nm處有明顯吸收峰,通過紫外掃描鑒別多糖中是否含有蛋白質(zhì)類雜質(zhì)[11]。

1.2.4 榨前分離蘋果皮多糖體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 測(cè)定不同組分多糖對(duì)·OH的清除能力 應(yīng)用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法檢測(cè)[12]。以不同組分蘋果皮多糖為自由基清除劑,測(cè)定蘋果皮多糖對(duì)·OH的清除能力。反應(yīng)體系中分別加入鄰二氮菲、pH7.4的磷酸緩沖液、FeSO4溶液、不同組分和濃度的蘋果皮多糖。蘋果皮多糖的濃度設(shè)定為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置加樣管、氧化管、對(duì)照管,37℃水浴鍋中保溫60min,在510nm處測(cè)定吸光值,每個(gè)處理進(jìn)行三次重復(fù),以Vc作對(duì)照,計(jì)算清除率。鄰二氮菲-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系組成見表1。

式中：A0表示氧化管的吸光值；A1表示對(duì)照管的吸光值；A2表示加樣管的吸光值。

表1 鄰二氮菲-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系組成表Table 1 The composed table of the1,10-phenanthroline-Fe2+-H2O2 reaction system

式中：A0表示自氧化管氧化速率；A1表示加樣管氧化速率。

表2 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系組成表Table 2 The composed table of the self-oxidation of1,2,3-phentriol reaction system

1.2.4.3 測(cè)定不同組分多糖對(duì)DPPH·的清除能力 分別配制濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL的不同組分多糖溶液。移取各濃度的糖溶液2.0mL于小試管中,分別加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL并搖勻,靜置40min,以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇作空白調(diào)零[14],在525nm處測(cè)定吸光值,每個(gè)處理重復(fù)三次,以VC作對(duì)照,計(jì)算清除率。

式中：A0為未加蘋果皮多糖DPPH溶液的吸光值；Ai為加蘋果皮多糖后DPPH溶液的吸光值；Aj為對(duì)應(yīng)多糖溶液自身的吸光值。

1.2.4.4 不同組分多糖總還原力的測(cè)定 分別配置濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL的多糖溶液。取1mL多糖溶液,加入2.5mLpH6.6的磷酸鹽緩沖液,再加入2.5mL1%的鐵氰化鉀混勻,50℃水浴20min,立即加入2.5mL10%的TCA終止反應(yīng),4000r/min離心10min。取上清液2.5mL于試管中,先加入2.5mL無水乙醇,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液0.5mL,混勻,以蒸餾水作空白調(diào)零,以VC作對(duì)照,在700nm處測(cè)定吸光值[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1榨前分離蘋果皮多糖的分離純化

蘋果皮粗多糖(applepeelpolysaccharides,APPS)過DE-52纖維素柱,利用不同濃度的NaCl溶液梯度洗脫得到三個(gè)含量較大的洗脫峰,分別為蒸餾水洗脫峰、0.3mol/LNaCl洗脫峰、0.9mol/LNaCl洗脫峰,0.1、0.5、0.7mol/LNaCl洗脫未得到明顯的洗脫峰,將各組分再過SephadexG-200層析柱進(jìn)一步純化后,分別得到單一的洗脫峰,說明得到的三個(gè)組分均為分子量相同的同一組分,將其依次命名為APPS-H2O(水洗組分)、APPS-0.3mol/L(0.3mol/LNaCl洗脫組分)和APPS-0.9mol/L(0.9mol/LNaCl洗脫組分)。APPS-0.3mol/L、APPS-H2O和APPS-0.9mol/L三種組分多糖的得率分別為：19.3%、12.1%、8.2%。

圖1 蘋果皮多糖過Sephadex G-200 的洗脫曲線

2.2三種不同組分多糖的純度鑒定結(jié)果

對(duì)分離得到的三種不同組分蘋果皮多糖進(jìn)行紫外光譜掃描,結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)在260～280nm處沒有明顯的吸收峰,且茚三酮反應(yīng)結(jié)果為陰性,說明分離得到的三種多糖均不含蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)；苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑反應(yīng)結(jié)果均為陽性,說明三種組分由糖醛酸類糖組成；三氯化鐵反應(yīng)和碘-碘化鉀反應(yīng)均呈陰性,說明三種組分不含酚類物質(zhì),是非淀粉多糖。

不同多糖具有不同的比旋光度,利用這一原理可以鑒定三種多糖是否為同一多糖。此外,不同多糖在不同濃度的乙醇溶液中具有不同的溶解度,多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀,如所得沉淀物具有相同的比旋光度則證明該多糖為均一組分。通過對(duì)APPS-H2O,APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L三種多糖的比旋光度測(cè)定,發(fā)現(xiàn)三種多糖具有不同的比旋光度,說明分離純化得到的三種組分不是同一種多糖。經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀,所得沉淀物的比旋光度基本相同,說明三種多糖均為均一多糖。

圖2 三種不同組分蘋果皮多糖的紫外掃描圖譜

2.3榨前分離蘋果皮多糖體外抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

2.3.1 三種不同組分多糖對(duì)·OH的清除能力 由圖3可以看出,粗多糖及分離純化得到的三種組分多糖均具有一定的清除·OH能力,其清除能力與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān),濃度越高其清除能力越強(qiáng)。APPS-H2O清除·OH能力強(qiáng)于APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L,而后兩者清除·OH的能力相當(dāng)。原因可能是多糖對(duì)·OH的清除能力與多糖的極性有關(guān),而水洗組分APPS-H2O為復(fù)合有酚類基團(tuán)的弱極性組分,所以其抗氧化活性強(qiáng)于鹽洗組分APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L[9]。

圖3 三種不同組分多糖清除·OH的能力

圖4 三種不同組分多糖清除·的能力

2.3.3 三種不同組分多糖對(duì)DPPH·的清除能力 由圖5可以看出,三種組分多糖均有一定的清除DPPH·能力,其清除DPPH·能力與多糖濃度在一定的濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)。APPS-H2O清除DPPH·能力強(qiáng)于APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L。這可能與多糖的極性有關(guān),水洗組分APPS-H2O的極性比鹽洗組分APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L低,極性越弱,其清除能力越強(qiáng),抗氧化活性越高。這一結(jié)果與前人在多糖純化中取得的結(jié)果相同[9]。

圖5 三種不同組分多糖清除DPPH·的能力

2.3.4 三種不同組分多糖的總還原力測(cè)定 由圖6可以看出,三種組分多糖均有一定的還原力,但是OD值均很小。在相同濃度下,APPS-H2O的還原力略高于APPS-0.3mol/L和APPS-0.9mol/L,而后兩者的還原力較接近,在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出量效關(guān)系,即隨著多糖濃度的增加,其還原力也逐漸增加。多糖經(jīng)過純化后,還原力均比粗多糖要低,且低于Vc。原因可能為：在純化過程中粗多糖中抗氧化能力較強(qiáng)的酚類物質(zhì)被滯留而與純品組分分離,導(dǎo)致純品的總還原力降低[17]。

圖6 三種不同組分還原力測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

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Purification and antioxidative activity of polysaccharides from cold-extracting apple peel

DOUJiao,GUOYu-rong*,XUEZhan-feng,CHENWei-qi,LIJin-yun,MENGYong-hong

(Shaanxi Normal University,College of Food Engineering and Nutritional Science,Xi’an 710062,China)

apple peel;polysaeeharides;isolation and purification;antioxidative activity

2013-07-09 *通訊聯(lián)系人

竇姣(1990-)，女，碩士，主要從事食品功能成分開發(fā)及利用方面的研究。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金資助(CARS-28)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0111-05