盧春芳 劉國娟 劉大程* 胡紅蓮 高 民
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010018;2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,呼和浩特 010031)
我國微生態(tài)制劑的研究工作多集中在單胃動(dòng)物上,而有關(guān)專門針對反芻動(dòng)物研制的微生態(tài)制劑的研究報(bào)道較少。近年來,研究者們開始了利用微生態(tài)制劑來調(diào)控瘤胃功能,從而提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的研究[1],其中針對酵母菌及其培養(yǎng)物的研究尤其突出。大量研究表明,添加酵母菌及其培養(yǎng)物可以提高瘤胃中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)消化率及瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid,TVFA)濃度及乙酸與丙酸比[2-3],還可增加奶牛產(chǎn)奶量,提高乳脂率[4],減輕環(huán)境應(yīng)激對家畜造成的危害[5-6]。同時(shí),酵母菌及其培養(yǎng)物在穩(wěn)定瘤胃液pH及預(yù)防亞急性瘤胃酸中毒方面也起著積極的作用[7-8]。
酵母菌培養(yǎng)物屬于動(dòng)物微生態(tài)制劑領(lǐng)域的范疇,是一種由少量活菌細(xì)胞、大量細(xì)胞代謝產(chǎn)物(cell metabolites)和發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentation medium)組成的混合物,其核心價(jià)值在于它含有的發(fā)酵代謝物(fermentation metabolites),主要包括營養(yǎng)活性物質(zhì)(nutricines)、增味劑(taste-enhancer)、芳香物質(zhì)(aromatic substance)及一些促進(jìn)畜禽生長的未知因子等。本課題組前期研究表明復(fù)合酵母菌在特殊發(fā)酵工藝下產(chǎn)生的營養(yǎng)活性物質(zhì)主要有5種,分別為β-葡聚糖(β-glucan)、甘露聚糖(mannan)、多肽(polypeptides)、有機(jī)酸(organic acids)和氨基酸(amino acids)[9]。這些營養(yǎng)活性物質(zhì)在改善動(dòng)物消化道菌群結(jié)構(gòu)、保持腸道微生態(tài)平衡及提高瘤胃功能等方面均起著重要作用。在營養(yǎng)活性物質(zhì)功效方面,研究者們越來越重視營養(yǎng)活性物質(zhì)之間的組合效應(yīng)。基于“營養(yǎng)活性物質(zhì)組學(xué)理論”[10],本課題組在研究復(fù)合酵母菌培養(yǎng)物過程中更強(qiáng)調(diào)5種營養(yǎng)活性物質(zhì)間相互作用的整體效果。酵母菌產(chǎn)品作用效果的差異很大程度上源于所用菌株的差異[11],用作飼料添加劑的酵母菌株數(shù)量很多,但是不同菌株對瘤胃微生物的作用效果不同,進(jìn)而對瘤胃發(fā)酵及動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生不同的效應(yīng)[12],可見優(yōu)良的酵母菌株是反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)[13]。本試驗(yàn)通過對6株酵母菌代謝產(chǎn)生營養(yǎng)活性物質(zhì)的能力進(jìn)行比較與分析,從而篩選出優(yōu)良菌株,為后期反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑的研制奠定基礎(chǔ)。
產(chǎn)朊假絲酵母(Cadida atilis)BY、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)BR、熱帶假絲酵母B2、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YR、釀酒酵母YC和釀酒酵母BC,均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑課題組菌種庫。
6株酵母菌分別接種到麥芽汁培養(yǎng)基中,180 r/min、30℃培養(yǎng)48 h;以不接菌的麥芽汁培養(yǎng)基作為空白對照,每個(gè)樣品3個(gè)平行。
酵母菌破壁:采用渦流微珠破壁法[14]。
硫酸水解:用72%的硫酸溶液處理[15]。分別稱取 β-葡聚糖、甘露聚糖各5.00、6.25、7.50、8.75、10.00、12.50、15.00 mg,硫酸水解后使多糖終濃度為 0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.50、0.60 mg/mL。
單糖含量測定:采用液相色譜-示差折光檢測器測定7個(gè)樣品及校正多糖中甘露糖和葡萄糖含量[16]。
結(jié)果計(jì)算:以校正多糖的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制校正曲線,得出回歸方程。樣品的峰面積代入回歸方程中計(jì)算得到酵母菌細(xì)胞壁中β-葡聚糖及甘露聚糖含量。
采用安捷倫LC1100液相色譜儀測定有機(jī)酸含量[17]。
采用日立L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀測定氨基酸含量[18]。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:以牛血清白蛋白的含量為橫坐標(biāo),其在595 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。
多肽提取:量取酵母菌培養(yǎng)液5.00 mL于50 mL離心管中,加入10 mL 75%的乙醇和5 mL、pH 4.8的檸檬酸,充分混勻,用4 000 r/min離心10 min,取上清液。
多肽含量測定:取3支試管,各吸取樣品上清液1 mL,各加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液5.0 mL,充分振蕩混勻,靜置5 min后,測定595 nm處的吸光度值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中多肽的含量。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著;使用DPS 14.10軟件運(yùn)用Topsis法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多試驗(yàn)、多指標(biāo)綜合分析[20]。
β-葡聚糖的校正方程為y=603 391x-3 997.7(R2=99.12),說明 β-葡聚糖含量在0.2~0.6 mg/mL范圍內(nèi)多糖濃度與單糖峰面積具有良好的線性相關(guān)。甘露聚糖的校正方程為y=82 792x-11 326(R2=99.25),說明 0.2~0.6 mg/mL范圍內(nèi)的多糖濃度與單糖峰面積呈良好線性相關(guān)。
由表1可知,產(chǎn)β-葡聚糖能力最強(qiáng)的菌株為熱帶假絲酵母BR,其細(xì)胞壁中β-葡聚糖含量高達(dá)80.2 mg/g,顯著高于其他5株酵母菌(P<0.05),產(chǎn)朊假絲酵母BY和熱帶假絲酵母B2次之,其細(xì)胞壁中β-葡聚糖含量分別為62.8和59.1 mg/g,釀酒酵母YR、釀酒酵母YC、熱帶假絲酵母B2三者差異不顯著(P>0.05)。同時(shí),熱帶假絲酵母BR產(chǎn)甘露聚糖能力也最強(qiáng),其細(xì)胞壁中甘露聚糖含量達(dá)60.5 mg/g,顯著高于產(chǎn)朊假絲酵母BY、釀酒酵母BC、釀酒酵母YC(P<0.05),其次是熱帶假絲酵母B2和釀酒酵母YR,其細(xì)胞壁中甘露聚糖含量分別為51.9和48.1 mg/g。綜合上述2個(gè)指標(biāo),熱帶假絲酵母BR優(yōu)于其他5株酵母菌。
表1 不同酵母菌細(xì)胞壁中β-葡聚糖、甘露聚糖的含量Table 1 The contents of β-glucan and mannan in cell walls of different yeasts mg/g
由表2可知,6株不同酵母菌培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量均顯著高于空白對照(P<0.05),但不同酵母菌之間產(chǎn)有機(jī)酸的能力有較大差異。其中,產(chǎn)酒石酸能力較強(qiáng)的菌株是熱帶假絲酵母BR和產(chǎn)朊假絲酵母BY,其培養(yǎng)液中酒石酸含量分別為85.61和83.84 μg/mL,顯著高于其他菌株(P<0.05),其次是釀酒酵母YR、釀酒酵母YC及釀酒酵母BC,其培養(yǎng)液中酒石酸含量分別為63.53、60.46和56.73 μg/mL,顯著高于熱帶假絲酵母B2(P<0.05);產(chǎn)朊假絲酵母BY產(chǎn)蘋果酸能力最強(qiáng),其培養(yǎng)液中蘋果酸含量為92.53 μg/mL,顯著高于其他菌株(P<0.05),釀酒酵母YC和釀酒酵母YR稍次之,其培養(yǎng)液中蘋果酸含量分別為76.55和71.63 μg/mL;產(chǎn)檸檬酸能力較強(qiáng)的菌株是熱帶假絲酵母B2和產(chǎn)朊假絲酵母BY,其培養(yǎng)液中檸檬酸含量分別高達(dá) 111.05和94.49 μg/mL,顯著高于其他菌株(P <0.05),其次是釀酒酵母YR、釀酒酵母YC及釀酒酵母BC,其培養(yǎng)液中檸檬酸含量分別為76.52、68.71和61.85 μg/mL;熱帶假絲酵母BR產(chǎn)丁二酸能力最強(qiáng),其培養(yǎng)液中丁二酸含量為119.70 μg/mL,顯著高于其他菌株(P<0.05),其次是釀酒酵母BC、釀酒酵母YC、產(chǎn)朊假絲酵母BY、釀酒酵母YR,其培養(yǎng)液中丁二酸含量分別為88.90、76.69、73.61和71.61 μg/mL,熱帶假絲酵母B2培養(yǎng)液中丁二酸含量相比最低。6株酵母菌中產(chǎn)朊假絲酵母BY產(chǎn)酒石酸和蘋果酸能力均最強(qiáng),并且其培養(yǎng)液中總有機(jī)酸含量也顯著高于其他菌株(P<0.05),達(dá)到344.46 μg/mL,顯著高于其他5株酵母菌(P<0.05);熱帶假絲酵母BR產(chǎn)丁二酸能力最強(qiáng),同時(shí)其培養(yǎng)液中總有機(jī)酸含量達(dá)到312.11 μg/mL,位列第2,顯著高于其他4株酵母菌(P<0.05)。
由表3可知,6株酵母菌培養(yǎng)液中總氨基酸的含量無顯著差異(P<0.05);熱帶假絲酵母BR、產(chǎn)朊假絲酵母BY、熱帶假絲酵母B2產(chǎn)谷氨酸能力較高,其培養(yǎng)液中谷氨酸含量分別為0.915、0.910和0.910 mg/g,顯著高于釀酒酵母YR、釀酒酵母YC和釀酒酵母BC(P<0.05);釀酒酵母YR、釀酒酵母YC、產(chǎn)朊假絲酵母BY和釀酒酵母BC產(chǎn)甘氨酸能力較高,其培養(yǎng)液中谷氨酸含量顯著高于其余2株酵母菌(P<0.05);產(chǎn)朊假絲酵母BY產(chǎn)丙氨酸能力最高,其培養(yǎng)液中丙氨酸含量高達(dá)0.325 mg/g,顯著高于其他菌株(P<0.05);熱帶假絲酵母BR和熱帶假絲酵母B2產(chǎn)半胱氨酸能力較高,其培養(yǎng)液中半胱氨酸含量分別為0.115、0.120 mg/g,顯著高于其他菌株(P<0.05);釀酒酵母YR、產(chǎn)朊假絲酵母BY、釀酒酵母BC產(chǎn)纈氨酸能力較高,其培養(yǎng)液中纈氨酸含量均為0.305 mg/g,顯著高于熱帶假絲酵母BR和熱帶假絲酵母B2(P<0.05);釀酒酵母YR產(chǎn)蛋氨酸能力最高,其培養(yǎng)液中蛋氨酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05);產(chǎn)朊假絲酵母BY產(chǎn)酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸能力最高,其培養(yǎng)液中酪氨酸、苯丙氨酸、脯 氨 酸 含 量 分 別 為 0.085、0.235、0.365 mg/g,酪氨酸、苯丙氨酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05),脯氨酸含量顯著高于熱帶假絲酵母B2和熱帶假絲酵母BR(P<0.05)。
表2 不同酵母菌培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量Table 2 The contents of organic acids in cultures of different yeasts μg/mL
表3 不同酵母菌培養(yǎng)液中氨基酸含量Table 3 The contents of amino acids in cultures of different yeasts mg/g
由表4可知,6株酵母菌培養(yǎng)液中多肽含量均顯著高于空白對照(P<0.05)。其中,釀酒酵母BC產(chǎn)多肽能力最高,其培養(yǎng)液中多肽含量達(dá)到14.08 mg/dL,顯著高于其他菌株(P<0.05)。釀酒酵母YR、釀酒酵母YC、熱帶假絲酵母B2產(chǎn)多肽能力次之,其培養(yǎng)液中多肽含量分別為12.33、12.41、12.79 mg/dL,三者之間差異不顯著(P>0.05),但顯著高于熱帶假絲酵母BR和產(chǎn)朊假絲酵母BY(P<0.05)。
表4 不同酵母菌培養(yǎng)液中多肽含量Table 4 The content of polypeptide in cultures of different yeasts mg/dL
依據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果使用DPS 14.10軟件運(yùn)用Topsis法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多試驗(yàn)、多指標(biāo)綜合分析,得出結(jié)論見表5??芍顑?yōu)的菌株為熱帶假絲酵母BR,其細(xì)胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖含量分別為80.2和60.5 mg/g,優(yōu)于其他菌株,其培養(yǎng)液中多肽含量為114.2 μg/L,氨基酸和有機(jī)酸含量分別為4.625 mg/g和312.11 μg/mL;其次為產(chǎn)朊假絲酵母BY,其產(chǎn)有機(jī)酸能力較強(qiáng),培養(yǎng)液中酒石酸、蘋果酸、總有機(jī)酸含量分別為83.84、92.53、344.46 μg/mL,優(yōu)于其他5株酵母菌。
表5 6株酵母菌Topsis法排序指標(biāo)值Table 5 The ranking index values of 6 yeasts by Topsis method
近年來,酵母菌類產(chǎn)品在反芻動(dòng)物上的應(yīng)用已有較多報(bào)道,大量試驗(yàn)表明添加酵母菌對反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵、飼料消化率及生產(chǎn)性能等方面都有積極的影響[12]。但由于所用的發(fā)酵菌種類不同、發(fā)酵工藝各異,致使產(chǎn)品的作用效果參差不齊。這種作用效果的差異與酵母菌菌種的結(jié)構(gòu)及生物活性密切相關(guān)[21]。本課題組致力于反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑的研究,從30余株酵母菌中初篩出6株菌株,本試驗(yàn)對這6株酵母菌產(chǎn)生5種營養(yǎng)活性物質(zhì)的能力進(jìn)行分析,得到了2株高活性菌株,分別為熱帶假絲酵母BR和產(chǎn)朊假絲酵母BY,這2株酵母菌在產(chǎn)β-葡聚糖、甘露聚糖及有機(jī)酸能力等方面具有明顯優(yōu)勢。酵母菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖[由D-葡聚糖通過β-(1→3)鍵的方式相結(jié)合]不同于植物細(xì)胞壁中的β-(1→4)葡聚糖,它在消化道中不可溶、不被吸收,同時(shí)不產(chǎn)生黏性,更重要的是它是一種免疫促進(jìn)劑,能夠增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力,改善動(dòng)物消化道的菌群結(jié)構(gòu);甘露聚糖是一種免疫功能很強(qiáng)的細(xì)胞壁多糖,它不僅能增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力,還能吸附外源性毒素(heterotoxin)和病原菌(pathogens),在保持腸道微生態(tài)平衡方面起重要作用;酵母菌培養(yǎng)物中的多肽能夠直接被動(dòng)物吸收,參與機(jī)體生理活動(dòng)和代謝調(diào)節(jié),從而促進(jìn)動(dòng)物生長、提高生產(chǎn)性能、改善產(chǎn)品品質(zhì)和動(dòng)物健康狀態(tài);復(fù)合酵母菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的有機(jī)酸主要有蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和酒石酸,不同的有機(jī)酸均表現(xiàn)出較好的瘤胃調(diào)控功能。另外,反芻動(dòng)物對特定氨基酸的需求比對特定蛋白質(zhì)的需求更重要,增加動(dòng)物某種限制性氨基酸會(huì)使其氨基酸的利用率提高。
優(yōu)良菌株是決定微生態(tài)制劑品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一,本試驗(yàn)篩選出的優(yōu)良菌株為研制反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑奠定了良好的基礎(chǔ),從而從根本上避免了生產(chǎn)中常見的盲目使用菌株的不科學(xué)現(xiàn)象。
近幾年,飼料中營養(yǎng)活性物質(zhì)的功效越來越受到研究者的重視。營養(yǎng)活性物質(zhì)是飼料中天然存在的有特殊營養(yǎng)作用的微量組分,具有刺激機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收,與基因組互作,增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能,調(diào)節(jié)消化道菌群平衡,保持飼料品質(zhì)等作用[22],在改善動(dòng)物健康和調(diào)節(jié)新陳代謝方面也發(fā)揮著很大功效[23]。營養(yǎng)活性物質(zhì)是將健康和營養(yǎng)聯(lián)系起來的飼料組分,并在全方位營養(yǎng)中起著越來越重要的作用。目前研究的營養(yǎng)活性物質(zhì)主要包括抗氧化劑、乳化劑、酶、不可消化的低聚糖和有機(jī)酸等。酵母菌自身含有多量的營養(yǎng)物質(zhì)并可以通過發(fā)酵過程而產(chǎn)生多種營養(yǎng)活性物質(zhì),如β-葡聚糖、甘露聚糖、有機(jī)酸等。當(dāng)給奶牛飼喂酵母菌培養(yǎng)物后,一方面,β-葡聚糖、有機(jī)酸等營養(yǎng)活性物質(zhì)能為瘤胃內(nèi)某些細(xì)菌的生長提供特殊的發(fā)酵底物,通過刺激瘤胃細(xì)菌的生長來提高飼料轉(zhuǎn)化率;另一方面,酵母菌培養(yǎng)物中的β-葡聚糖和甘露聚糖是2種免疫活性多糖,二者均有激活機(jī)體免疫系統(tǒng)和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的功效[24-25],達(dá)到了增強(qiáng)奶牛免疫功能、減少乳汁體細(xì)胞數(shù)的效果,從而使奶牛的乳房更加健康,產(chǎn)奶量也隨之相應(yīng)增加。本試驗(yàn)通過多指標(biāo)綜合分析得到最優(yōu)菌株為熱帶假絲酵母BR,其細(xì)胞壁中β-葡聚糖、甘露聚糖含量分別為80.2和60.5 mg/g,分別是釀酒酵母BC的1.5倍以上;產(chǎn)丁二酸和酒石酸的能力最強(qiáng),其培養(yǎng)液中丁二酸和酒石酸含量分別為119.70和85.61 μg/mL,分別約是熱帶假絲酵母B2的3和2倍,且其培養(yǎng)液中總有機(jī)酸含量達(dá)到312.11 μg/mL。這些營養(yǎng)活性物質(zhì)在調(diào)控瘤胃發(fā)酵功能和提高動(dòng)物免疫機(jī)能方面將發(fā)揮積極的功效。
酵母菌細(xì)胞壁厚且堅(jiān)韌,所以破壁效果成為制約酵母菌胞內(nèi)營養(yǎng)活性物質(zhì)測定準(zhǔn)確與否的主要瓶頸。本研究選用渦流微珠破壁法,利用微珠和物料之間的研磨、粉碎、剪切、擠壓等機(jī)械力來打碎細(xì)胞壁[26]。該方法破壁率高,能有效測定胞內(nèi)及細(xì)胞壁上的營養(yǎng)活性物質(zhì)含量,為本試驗(yàn)的酵母菌細(xì)胞壁中多糖含量的測定奠定了基礎(chǔ)。又因?yàn)槎嗵墙Y(jié)構(gòu)復(fù)雜,難以直接準(zhǔn)確測定,所以本試驗(yàn)將多糖酸解為葡萄糖和甘露糖后采用液相色譜-示差折光檢測器測定,使結(jié)果更加精準(zhǔn)可靠?;谄咸烟呛透事短堑姆肿邮骄鶠镃6H12O6,相對分子質(zhì)量為180.16,多糖酸解后殘基分子式為C6H10O5,相對分子質(zhì)量是162.16,也就是說殘基相對分子質(zhì)量與單糖的相對分子質(zhì)量之比為0.9。所以,大部分研究都是簡單地以測試樣品的單糖含量乘以0.9來作為多糖含量。但是,該計(jì)算結(jié)果受多糖水解程度的影響,水解不徹底會(huì)使測定結(jié)果偏小。本文運(yùn)用外標(biāo)法,將高純度的2種多糖試劑進(jìn)行硫酸水解后,測定單糖含量,并做成梯度繪制校正曲線。只要樣品濃度在曲線范圍內(nèi)就表示多糖水解程度與校正曲線走向一致,將其峰面積代入校正曲線,得出樣品β-葡聚糖和甘露聚糖含量,使測定結(jié)果更精準(zhǔn)可靠。
①熱帶假絲酵母BR產(chǎn)β-葡聚糖、甘露聚糖能力最強(qiáng),其細(xì)胞壁中β-葡聚糖、甘露聚糖含量分別為80.2、60.5 mg/g;產(chǎn)朊假絲酵母BY產(chǎn)有機(jī)酸能力最強(qiáng),其培養(yǎng)液中總有機(jī)酸含量為344.46 μg/mL;釀酒酵母BC產(chǎn)多肽能力最強(qiáng),其培養(yǎng)液中多肽含量為14.08 mg/dL。
②多指標(biāo)綜合分析得出最優(yōu)菌株為熱帶假絲酵母BR,其產(chǎn)β-葡聚糖、甘露聚糖能力最強(qiáng),細(xì)胞壁中β-葡聚糖、甘露聚糖含量分別為80.2、60.5 mg/g;產(chǎn)丁二酸的能力最強(qiáng),培養(yǎng)液中丁二酸含量為119.70 μg/mL,且總有機(jī)酸含量達(dá)到312.11 μg/mL;產(chǎn)生谷氨酸和半胱氨酸能力最強(qiáng),培養(yǎng)液中谷氨酸和半胱氨酸含量分別為0.915和0.115 mg/g,且總氨基酸含量達(dá)到4.705 mg/g。
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動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)2014年2期