超高壓處理對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

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(合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

超高壓處理對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

葛梅,梁娟,潘見,孟飛龍,徐金鳳,謝慧明*

(合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

為保留菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性,探討了超高壓處理中壓力、保壓時間和溫度對菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響,并考察其在模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:壓力、保壓時間和溫度均對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響顯著,壓力300MPa、溫度30℃、保壓10min時菠蘿蛋白酶的纖溶活性比未處理樣高65.54%；300MPa保壓10min(30℃)處理的菠蘿汁在模擬胃液和腸液各處理4h后,纖溶活性殘留率分別為37.91%和85.33%,均高于鮮榨汁。說明,通過調(diào)整超高壓處理條件,可以提高菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性及其對模擬胃腸液的耐受性。

超高壓,菠蘿蛋白酶,纖溶活性,胃腸道消化液

栓塞性疾病嚴重危害人類的生命健康,尤其是心腦血管栓塞性疾病是危害中老年人健康最嚴重又常見的疾病之一[1]。從膳食成分中尋找和開發(fā)抗栓和溶栓的物質(zhì)具有廣泛的臨床實用價值。

菠蘿中含有的菠蘿蛋白酶具有抗炎、抗腫瘤、抗血栓、溶解纖維蛋白、抗血小板聚集、增強抗生素效應(yīng)和助消化等功能[2-4],其中抗血栓、抗腫瘤、抗炎及抗血小板聚集功能均與其纖溶功能有關(guān)[5-6]。纖維蛋白也是血栓的主要組成成分之一。菠蘿蛋白酶在胃液中不穩(wěn)定,臨床上常用菠蘿蛋白酶腸溶片,口服后能加強體內(nèi)纖維蛋白的水解作用,將阻塞于組織的纖維蛋白及血凝塊溶解,從而改善體液的局部循環(huán),促使炎癥和水腫的消除。

菠蘿蛋白酶對熱敏感,40℃以上條件下酶活半衰期在2h以內(nèi),熱變性溫度在55～60℃[7],傳統(tǒng)的熱加工方式易使其失活。食品超高壓加工技術(shù)屬于非熱力殺菌,能在殺菌的同時最大程度地保留果蔬汁的香氣成分、營養(yǎng)物質(zhì)以及生物活性。關(guān)于超高壓菠蘿汁的研究[8-11]主要集中在以不同的殺菌方式獲得的菠蘿汁的殺菌效果、感官品質(zhì)、理化指標的對比,對超高壓菠蘿汁的溶纖功能的研究目前鮮見報道。

超高壓處理中,酶的活性不僅取決于壓力的大小,同時與處理溫度、保壓時間和處理對象的化學組成有關(guān)系。本研究以菠蘿汁中菠蘿蛋白酶為對象,研究超高壓處理壓力、溫度、保壓時間對菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響,并探討其消化性質(zhì),以期為功能菠蘿汁超高壓加工技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

市售菠蘿(產(chǎn)地海南)七成熟 購自合肥周谷堆農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場。

凝血酶(酶活力62U/mg)、牛纖維蛋白原 購自sigma；尿激酶(酶活力1240U/支) 購自中國食品藥品檢定研究院；考馬斯亮藍R250、瓊脂、胃蛋白酶(酶活力1∶3000)、胰酶(酶活力11*USP) 購自上海生工生物有限公司。

1L YCB630/2.5食品超高壓設(shè)備(工作壓力0～600MPa,工作溫度0～50℃) 兵器工業(yè)第五二研究所國營七廠；JYZ-D520榨汁機 九陽股份有限公司；3K-15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DZ-400/2S真空包裝機 浙江金華市包裝機械有限公司；G-135電子天平 德國梅特勒-托利多公司；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HH恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 試樣的制備 菠蘿→去皮、去目、切端→清洗、切塊→榨汁→4層紗布過濾→均質(zhì)→真空脫氣5min→灌裝→超高壓處理→檢測

所制菠蘿汁樣品存放于4℃冰箱內(nèi),在12h內(nèi)完成超高壓處理。

1.2.2 超高壓處理 所制菠蘿汁用聚乙烯塑料袋真空密封包裝2層(不留頂隙,15mL/袋),按照實驗設(shè)計,設(shè)定壓力、溫度和保壓時間3個參數(shù)進行超高壓處理。進行溫度因素考察時需提前調(diào)節(jié)高壓容器外夾套中介質(zhì)溫度使容器中介質(zhì)到達要求溫度后,將試樣浸沒此傳壓介質(zhì)中1min后再升壓。

處理后的樣品存放在4℃冰箱里,在24h內(nèi)完成檢測。所有數(shù)據(jù)均為3個試樣測定后的平均值。受實驗條件的限制,無法一次性完成所有菠蘿汁樣品的制備、處理和檢測,單因素實驗和正交實驗所用菠蘿汁樣品批次不同。

1.2.3 超高壓單因素實驗

1.2.3.1 壓力的選擇 菠蘿汁pH3.70、處理溫度20℃、保壓時間10min的條件下,進行處理壓力為100、200、300和400MPa的超高壓處理,研究壓力對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響。平行測定3次,以未經(jīng)超高壓處理菠蘿汁(以下簡稱原樣)中菠蘿蛋白酶的纖溶活性作為參照(100%),菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性為指標。

1.2.3.2 保壓時間的選擇 pH3.70的菠蘿汁在處理溫度20℃、單因素壓力較優(yōu)條件下,進行保壓時間分別為5、10、15、20、25min的超高壓處理,考察保壓時間對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響。平行測定3次,以原樣中菠蘿蛋白酶的纖溶活性作為參照(100%),菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性為指標。

1.2.3.3 溫度的選擇 在常壓條件下和超高壓單因素較優(yōu)壓力和較優(yōu)保壓時間條件下分別對pH3.70的菠蘿汁進行5種不同溫度(10、20、30、40、50℃)的處理實驗,研究常壓和超高壓條件下溫度對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響。平行測定3次,以原樣中菠蘿蛋白酶的纖溶活性作為參照(100%),菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性為指標。

1.2.4 正交實驗優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取壓力、保壓時間和處理溫度3個因素,每個因素設(shè)計3個水平,以菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性為考察指標,按照L9(34)正交表進行實驗。正交實驗因素及水平設(shè)置如表1所示。

表1 超高壓處理正交實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal experiment

1.2.5 纖溶活性的測定 采用纖維平板法[12-13]并稍作修改測定菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性。

1.2.5.1 纖維蛋白平板的制備 用PBS配制10g/L的瓊脂溶液,加熱使其完全融化后取15mL放入燒杯中,冷卻至50℃時加入10g/L纖維蛋白原溶液0.5mL和100U/mL的凝血酶溶液20μL,快速混勻后倒入9cm的皮氏平皿中。室溫下放置1h以形成纖維蛋白凝塊。

1.2.5.2 尿激酶標準曲線的制作 用PBS溶液(pH7.4)將尿激酶標準品稀釋成20、30、40、50、100、150、200、250U/mL 8個濃度。用直徑3mm的打孔器在新制備的纖維蛋白平板上打孔,然后向其中加入10μL的上述不同濃度的尿激酶溶液,室溫放置10min后37℃培養(yǎng)18h,用考馬斯亮藍染色液染色(考馬斯亮藍R250 0.1%,甲醇12%,冰乙酸10%)15min,然后用脫色液(甲醇20%,冰乙酸8%)脫色至能看見清楚的裂解圈為止。用游標卡尺測量裂解圈相互垂直的兩條直徑值,計算兩條直徑的乘積作為裂解圈的面積,重復(fù)測定3次求平均值。以尿激酶活力單位數(shù)C(U/mL)的對數(shù)log C為橫坐標,裂解圈的面積A(mm2)的對數(shù)值log A為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.5.3 試樣纖溶活性的測定 取待測菠蘿汁樣品于4℃離心10min(6000×g),棄去沉淀,取上清液10μL點樣于纖維蛋白平板樣孔中,按上述方法進行操作,測定裂解圈的直徑后取平均值,根據(jù)尿激酶標準曲線求出樣品的纖溶活性。

1.2.6 模擬胃液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響 模擬胃液[14]:稱取0.2g NaCl和0.13g胃蛋白酶,加入70mL重蒸餾水,用HCl調(diào)pH至1.2,加水定容至100mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

在10mL離心管中加入1.9mL模擬胃液,37℃恒溫水浴預(yù)熱5min。加入500μL待測菠蘿汁樣品,迅速混勻后置于37℃水浴中,準確記錄時間,分別在反應(yīng)15、30、60、120、180、240min后取出100μL反應(yīng)液于1.5mL離心管中,速置于冰浴中存放。以1.9mL重蒸餾水加500μL菠蘿汁作為試樣對照。另取10mL離心管加入1.9mL模擬胃液和500μL重蒸餾水作為模擬胃液對照。各取樣10μL測定反應(yīng)前后的纖溶活性。

1.2.7 模擬腸液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響 模擬腸液[14]:稱取0.7g KH2PO4溶于25mL重蒸餾水中,攪拌使之完全溶解,加入19mL 0.2mol/L NaOH和40mL重蒸餾水,再加入0.09g胰酶,用0.2mol/L NaOH調(diào)pH至7.5,加重蒸餾水定容至100mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

在10mL離心管加入1.9mL模擬腸液,37℃恒溫水浴預(yù)熱5min。加入200μL待測菠蘿汁樣品,迅速混勻后速置37℃水浴中,準確記錄時間,分別在反應(yīng)15、30、60、120、180、240min后取出100μL反應(yīng)液于1.5mL離心管中,速置于冰浴中存放。以1.9mL重蒸餾水加200μL菠蘿汁作為試樣對照。另取10mL離心管加入1.9mL模擬腸液和200μL重蒸餾水作為模擬腸液對照。各取樣10μL測定反應(yīng)前后的纖溶活性。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)均采用origin8.0和SPSS19.0進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1壓力對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

超高壓處理壓力對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響如圖1所示。原樣中菠蘿蛋白酶的纖溶活性為252.89±11.24U/mL。由圖1所示,壓力100MPa時,菠蘿蛋白酶的纖溶活性比原樣高10.43%,隨著壓力的升高,超高壓菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性先增大后減小,于300MPa壓力時達到最大值173.83%。方差分析結(jié)果顯示,超高壓處理壓力對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性影響極顯著(p<0.01)。由此可知,處理壓力小于300MPa時,增大壓力有助于提高菠蘿蛋白酶的纖溶活性,其原因主要有以下3個方面:a.在完整組織中酶和底物經(jīng)常被膜隔離,較低的高壓處理可以破壞這種膜,使酶和底物相互接觸,從而引起酶促反應(yīng)的發(fā)生。b.超高壓處理可使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中暴露更多的巰基基團[15],菠蘿蛋白酶屬于半胱氨酸巰基蛋白酶,巰基是其催化活性的必須基團之一[16],巰基含量的增加使菠蘿蛋白酶的纖溶活性增加。c.α-螺旋結(jié)構(gòu)對菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用,酶活性降低時α-螺旋減少[17],而壓力較低時酶蛋白二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-折疊不被壓縮,甚至還會更加穩(wěn)定[18]。

圖1 壓力對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響Fig.1 Effect of pressure on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

壓力高于300MPa時,菠蘿蛋白酶的纖溶活性開始下降,但400MPa壓力下菠蘿蛋白酶的纖溶活性仍比原樣高20%左右,這與陶敏等[19]報道的400MPa條件下菠蘿蛋白酶的相對酶活下降10%有所不同,可能是由于菠蘿蛋白酶作用于不同底物時的最小鈍化壓力不同,亦或菠蘿蛋白酶對不同底物的作用方式也不同:陶敏等研究中的菠蘿蛋白酶的酶活系針對水解酪蛋白的活性；而菠蘿蛋白酶的纖溶活性除來自直接降解纖維蛋白外,還可通過激活纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶來降解纖維蛋白[5]。

2.2保壓時間對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

保壓時間對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響如圖2所示。由圖2可見,300MPa壓力下,隨著保壓時間的延長,菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性先增加后減少,但均高于未處理樣品。保壓10min時,菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性達到最大值163.24%。對五種保壓時間進行方差分析結(jié)果顯示,超高壓處理時保壓時間對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性影響顯著(p<0.05)。保壓時間大于15min后,菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性增加趨勢緩慢趨于平衡,此時保壓時間不再是影響纖溶活性的主要因素。

圖2 保壓時間對菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響Fig.2 Effect of holding time on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

2.3溫度對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

圖3可見,常壓下,10～50℃溫度范圍內(nèi),菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性隨著溫度的升高有所升高,在50℃時達到最高(115.33%)。而在300MPa壓力下,菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性隨著溫度升高呈先升高后下降趨勢,在40℃時達到最大值(150.71%),且不同溫度(10～50℃)協(xié)同超高壓處理對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性影響顯著(p<0.05)。在10～40℃溫度范圍內(nèi),經(jīng)300MPa處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的相對纖溶活性均高于常壓下的對應(yīng)值,可見在此溫度范圍內(nèi)超高壓處理有助于提高菠蘿蛋白酶的纖溶活性。這是因為在酶分子體系中,壓力和溫度對酶分子排列和空間構(gòu)象存在拮抗關(guān)系,在一定的溫度和壓力范圍內(nèi)增大壓力對酶起穩(wěn)定作用[18]。當溫度達到50℃時,溫度協(xié)同超高壓作用又促使菠蘿蛋白酶變性,則纖溶活性顯著降低。

圖3 溫度對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

2.4超高壓正交實驗結(jié)果

按表1的設(shè)計進行正交實驗,測定結(jié)果如表2所示。方差分析結(jié)果如表3所示。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交實驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of variance

由表2、表3可見,各因素對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響大小的順序依次為:壓力>溫度>保壓時間。其中,壓力對菠蘿蛋白酶的纖溶活性影響顯著,而溫度和保壓時間較不顯著。極差分析得出的最佳工藝組合為A2B1C3,即壓力300MPa,保壓時間10min,溫度40℃；而直觀分析得出的最佳組合為A2B1C2,即壓力300MPa,保壓時間10min,溫度30℃。選擇A2B1C2和A2B1C3進行驗證實驗發(fā)現(xiàn)2種工藝組合測得的菠蘿蛋白酶的纖溶活性差別不大,考慮到較低的處理溫度不僅能節(jié)約加工成本還可更多地保留菠蘿汁中的其他活性成分,選取壓力300MPa,保壓時間10min,溫度30℃作為保留菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的最佳超高壓處理條件。按此條件進行超高壓處理,菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性可達428.74U/mL,比原樣高65.54%。

2.5模擬胃液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

將原樣和300MPa保壓10min(30℃)處理的菠蘿汁在模擬胃液中作用不同時間后,菠蘿蛋白酶的纖溶活性變化趨勢如圖4所示。

圖4 模擬胃液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響Fig.4 Effect of simulated gastric juice on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

將各樣品點樣于纖維蛋白平板后發(fā)現(xiàn),模擬胃液不分解纖維蛋白。由圖4可知,隨著反應(yīng)時間的延長,原樣和超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的殘余纖溶活性均呈下降趨勢。反應(yīng)4h后,超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性殘留率為37.91%,比原樣高25.92%?？梢姴ぬ}汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性在模擬胃液中的損失較大。這是因為菠蘿蛋白酶的最適pH接近中性,pH為1.2的模擬胃液會降低其活性,也有可能這種低pH使得菠蘿蛋白酶酶聚集,一些活性基團被埋沒在分子內(nèi)部。此外胃蛋白酶對其也有分解作用。但是經(jīng)超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性損失較慢,且殘留率高于原樣。這與較低的高壓處理下酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定有關(guān)[18]。

2.6模擬腸液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響

纖溶活性測定結(jié)果顯示,模擬腸液對照可以溶解纖維蛋白,其纖溶活性為879.94±22.52U/mL,原樣和300MPa保壓10min(30℃)處理的菠蘿汁在模擬腸液中作用不同時間后菠蘿蛋白酶纖溶活性變化趨勢如圖5所示。

圖5 模擬腸液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響Fig.5 Effect of simulated intestinal juice on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

由圖5可知,隨著反應(yīng)時間的延長,原樣和超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性均呈緩慢下降趨勢,且經(jīng)超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性殘留率高于原樣。反應(yīng)4h后,超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性殘留率為85.53%,比原樣高11.2%。統(tǒng)計分析顯示模擬腸液對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性無顯著影響(p>0.25),說明菠蘿蛋白酶在小腸環(huán)境中較穩(wěn)定,胰酶對其影響很小,且經(jīng)過超高壓處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶對模擬腸液的耐受性提高。

本研究中模擬胃腸液的配制及其與目的蛋白的比例參照農(nóng)業(yè)部869公告中的規(guī)定,而目前關(guān)于目的蛋白與模擬胃腸液的比例并沒有統(tǒng)一的標準,各個實驗室進行模擬胃液消化的胃酸pH也從1.2～3.5不等[20]。為了能更真實準確的反應(yīng)超高壓處理對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶消化穩(wěn)定性的影響,需要更進一步的研究。

3 結(jié)論

采用超高壓加工鮮榨菠蘿汁時,壓力、保壓時間和溫度均對菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性影響顯著,30℃、300MPa加壓10min時菠蘿蛋白酶的纖溶活性可達428.74U/mL,比鮮榨汁高65.54%。超高壓處理不僅能提高菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性,而且300MPa加壓10min(30℃)處理的菠蘿汁中菠蘿蛋白酶對模擬胃腸液的耐受性提高,其在模擬胃液和和模擬腸液中各作用4h后纖溶活性殘留率分別為37.91%和85.33%,均高于鮮榨汁。

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Effect of ultra-high pressure treatment on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

GEMei,LIANGJuan,PANJian,MENGFei-long,XUJin-feng,XIEHui-ming*

(Engineering Research Center of Bio-process,Ministry of Education,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

To preserve fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice,the effect of different pressures,temperatures and pressure holding times on the fibrinolytic activity of bromelain was investigated. Stability of bromelain in simulated gastrointestinal digestive fluid were also studied. Results showed that all the factors had significant effects on fibrinolytic activity of bromelain. At 300MPa(30℃,10min),the fibrinolytic activity of bromelain was 65.54% higher than that of fresh pineapple juice. After 4h incubation in simulated gastric fluid or intestinal fluid at 300MPa(10min,30℃),the residual fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice was 37.91% or 85.33%,respectively,which were both higher than that of fresh pineapple juice. It indicated that ultra high pressure treatment could improve the fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice and its tolerance to simulated gastrointestinal fluid by adjusting the processing parameters.

ultra-high pressure;bromelain;fibrinolytic activity;gastrointestinal digestive fluid

2014-01-17 *通訊聯(lián)系人

葛梅(1989-),女,碩士研究生,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代加工技術(shù)與裝備。

國家“863”計劃項目(2011AA100801-05)。

TS255.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001