兩種脫細胞真皮基質(zhì)材料在兔顱骨缺損引導骨再生術(shù)中的成骨效果評估

陳暢行，宋曉陵，達靜姝，陳 武

(江蘇南京210009:1.南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周科;2.南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院病理科;3.南京醫(yī)科大學口腔醫(yī)學研究所)

GBR(guided bone regeneration)是針對骨組織的一項引導性組織再生(guided tissue regeneration，GTR)技術(shù)。面對臨床上越來越多有牙周炎病史或者缺牙時間過長患者的種植修復需要，為了解決種植區(qū)牙槽骨量不足不能滿足種植體最佳植入位置所需要的相應軟硬組織體積這一問題，常需采用GBR技術(shù)進行種植術(shù)區(qū)的骨增量治療。目前，GBR技術(shù)已經(jīng)成為臨床上解決患者種植體植入后局限性骨量不足以及種植術(shù)區(qū)骨缺損修復的重要手段［1］。

GBR技術(shù)中，屏障膜材料的選擇是決定其引導骨組織再生效果的關(guān)鍵。目前最常用的膜材料為可吸收性膠原膜，并已被大量研究證實其在GBR過程中能發(fā)揮良好的屏障膜作用［2］。除此之外，近年來又推出了一種成本相對低廉的脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix，ADM)膜，也是一種可吸收膜材料，并已開始應用于臨床。但ADM材料作為屏障膜在GBR技術(shù)中所發(fā)揮的實際效果，目前尚未得到充分的評價和驗證。本實驗以兔為實驗對象建立顱頂骨缺損動物模型［3-4］，分別將兩種不同動物來源的ADM材料配合骨替代物共同應用于動物骨缺損GBR技術(shù)中［5-6］，并以屏障效果肯定的膠原膜作為陽性對照，以驗證不同ADM材料作為屏障膜引導骨組織再生的效果。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

新西蘭大白兔(南京醫(yī)科大學實驗動物研究中心提供);豬脫細胞真皮基質(zhì)(porcine acellular dermal matrix，P-ADM)膜(10 mm ×10 mm，厚度1～1.5 mm，北京大清生物技術(shù)有限公司提供);牛脫細胞真皮基質(zhì)(bovine acellular dermal matrix，B-ADM)膜(商品名海奧口腔修復膜，10 mm×10 mm，B型，煙臺正海生物科技公司提供);瑞士Geistilich公司產(chǎn)膠原膜(Bio-gide Collagen membrane，10 mm×10 mm)。羥基磷灰石-磷酸鈣雙相復合骨替代材料(60%HA-40%TCP，Ф700 ～900 μm，上海貝奧路生物材料有限公司提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔顱頂骨缺損模型的建立

取1～2周齡健康雄性新西蘭大白兔20只(體質(zhì)量1.5～2 kg)，20%烏拉坦氯化鈉注射液耳緣靜脈注射(3～4 mL/kg體質(zhì)量)麻醉后，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，并于顱頂部作環(huán)形切口;分離軟組織和骨膜并暴露顱頂骨后，用慢速直機(卡瓦K4)分別在矢狀縫兩側(cè)與兩眼眶后緣連線后5 mm處各制備一個直徑8 mm的全層顱骨缺損，注意保留完整的硬腦膜及骨膜組織。生理鹽水沖盡骨屑并拭干后，按以下分組進行相應的處理。

1.2.2 實驗分組和GBR處理

將上述制備有顱頂骨缺損的20只大白兔按觀察時間隨機分為8周、12周兩大組(每組10只共20個骨缺損區(qū));每一大組的20個骨缺損區(qū)再按不同處理方法各隨機分為 A、B、C、D、E 5個亞組(每組4個骨缺損區(qū))。其中A組骨缺損區(qū)植入HA-TCP，用P-ADM膜覆蓋后縫合;B組骨缺損區(qū)植入HA-TCP，用B-ADM膜覆蓋后縫合;C組骨缺損區(qū)植入 HA-TCP，用 Bio-gide膜覆蓋后縫合;D組骨缺損區(qū)僅植入HA-TCP直接縫合;E組骨缺損區(qū)不植入任何材料直接縫合。術(shù)后24～48 h肌肉注射10～20萬單位青霉素.術(shù)后10 d拆除縫線。所有動物均于相同條件下常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 取材和大體觀察

分別于術(shù)后8周和12周處死相應組大白兔，分別截取各缺損區(qū)及其周圍10 mm以內(nèi)的全層骨組織，并肉眼觀察各缺損區(qū)愈合情況和屏障膜降解情況。

1.2.4 組織學觀察

各組顱頂骨標本經(jīng)常規(guī)固定后樹脂包埋，用硬組織切片機(德國leica 2155)平行于骨組織面作水平方向切片(片厚5 mm)。然后取各標本中心層切片，分別進行HE染色和馬松染色(Masson Goldner Trlchrome)，光學顯微鏡下觀察新生骨組織成骨情況、新生組織血管化及其他組織學變化情況。HE染色切片用計算機圖像分析系統(tǒng)隨機采集同一樣本不同成骨區(qū)域40倍視野下的圖像各14張，并用圖像分析軟件IMAGEPRO PLUS 6.0進行定量分析，計算同一圖像下新生骨小梁面積(new bone area，NBA)占圖像骨缺損初始面積(total defect area，TDA)的百分比。取同一樣本所有圖像百分比均數(shù)作為該樣本新生骨量的百分比(The percentage of new bone ，PNB)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

觀察期間各組動物均進食、活動正常，并健康成活至處死;術(shù)后10 d拆線時，各動物的創(chuàng)口愈合均良好。

GBR術(shù)后8周，B、C組屏障膜材料均基本降解，而A組則余留有少量未降解的P-ADM，并與成骨區(qū)粘連。A、B、C、D組骨缺損區(qū)均可見少量HA-TCP顆粒殘余，并可探及實質(zhì)性修復;而E(空白對照)組骨缺損中心仍可探及小范圍不規(guī)則的骨組織缺損區(qū)(直徑1～2 mm)，其周圍可見新生骨組織。

術(shù)后12周，A、B、C、D組骨缺損區(qū)均無殘余的屏障膜材料存在，并可探及實質(zhì)性新生骨組織，其中D組新生骨組織表面可見少量HA-TCP顆粒;而E組骨缺損區(qū)亦可探及質(zhì)地較疏松的新生骨組織，中心區(qū)肉眼未見明顯骨缺損。

2.2 組織學觀察

8、12周各組成骨區(qū)域組織切片HE染色后光學顯微鏡觀察顯示:40倍視野下各組均可見新生骨小梁結(jié)構(gòu)和纖維結(jié)締組織，100倍視野下，部分樣本可見纖維結(jié)締組織區(qū)域內(nèi)有新生血管形成及未降解HA-TCP顆粒;馬松染色顯示:新生骨組織、纖維結(jié)締組織與宿主骨組織的顏色、形態(tài)均清晰可辨(圖1～8)。

圖1 12周B組成骨區(qū)，可見大量新生骨小梁組織(HE×40)

圖2 12周C組新生骨組織與宿主骨組織交界區(qū)域(HE×40)

圖3 12周A組成骨區(qū)，紅色深染處為新生骨小梁，紅色淡染處為未骨化的纖維結(jié)締組織(HE×40)

圖4 12周E組(空白組)成骨區(qū)，以纖維結(jié)締組織為主(HE×40)

圖5 8周B組新生骨組織與宿主骨組織交界區(qū)，黑色三角示未降解HA-TCP顆粒(Masson×100)

圖6 8周A組成骨區(qū)，藍染部分為纖維結(jié)締組織，三角(紅染部分)為已開始礦化的新生骨組織，箭頭示纖維結(jié)締組織間分布的新生血管(Masson×100)

圖7 8周D組成骨區(qū)，藍染處為纖維結(jié)締組織，三角部分為新生血管，箭頭示未降解HA-TCP顆粒(Masson×100)

圖8 8周C組成骨區(qū)，紅色深染處為已礦化的新生骨組織，紅色淡染處為未完全礦化的骨樣基質(zhì)(Masson×100)

2.3 組織學定量分析

GBR術(shù)后各組骨組織樣本新生骨量定量分析結(jié)果顯示:8、12周大組內(nèi)的新生骨量均為C組＞B組＞A組＞E組，其中除B組與C組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外，其余各組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);8、12周大組中各亞組兩兩相比，均為12周組高于8周組(P＜0.05)(表1)。

表1 各組新生骨量百分比比較(%，s)

表1 各組新生骨量百分比比較(%，s)

同一時間內(nèi)各組間相比，不同字母P＜0.05;*為同組內(nèi)12周與8周相比P＜0.05

組別 術(shù)后8周 術(shù)后12周HA-TCP+豬ADM 0.649±0.045a 0.757±0.024a*HA-TCP+牛ADM 0.697±0.011b 0.796±0.012b*HA-TCP+Bio-gide 0.704±0.014b 0.806±0.021b*單純HA-TCP 0.597±0.019c 0.721±0.024c*空白對照組 0.438±0.035d 0.624±0.022d*

3 討論

GBR技術(shù)中，屏障膜的使用是保障該技術(shù)成功的關(guān)鍵。屏障膜是一類能夠選擇性阻擋上皮和成纖維細胞進入擬成骨空間，同時又不妨礙組織缺損自然愈合過程的生物相容性膜材料［2，7］。屏障膜的使用一方面可以在局部維持足夠的成骨空間，以利于來充填足量的人工材料或自體骨;另一方面因其自身具有一定的穩(wěn)定性，可保證有充足的時間讓成骨細胞占據(jù)成骨空間，同時還可在其降解過程中讓新生血管長入，從而促進和引導屏障膜兩側(cè)組織的自我修復過程［8］。

Bio-gide膠原膜是一種已被實驗證實能有效發(fā)揮屏障膜作用的膠原膜材料［9］，以I型膠原纖維和Ⅲ型膠原纖維為主要成分構(gòu)成了空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并通過雙層膜設計而使其能保持較長時間的屏障作用。ADM則是動物皮膚通過去細胞、化學交聯(lián)等步驟處理后脫去表皮和真皮中的細胞成分，僅保留真皮的不溶性基質(zhì)成分所獲得的屏障膜材料，其具有較低的抗原性并能促進新生組織血管化［5，10］。ADM同樣為規(guī)則的空間三維網(wǎng)狀支架，Ⅰ型膠原纖維占主要地位，構(gòu)成ADM的基本骨架;Ⅲ型膠原纖維減少至原來真皮層的一半;Ⅳ型和Ⅶ型膠原纖維幾乎消失［10］。在GBR過程中以ADM材料和膠原膜作為屏障膜時，其空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)、誘導并促進宿主細胞長入;隨著成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞及多種生長因子的長入和增殖，便可形成新生骨組織和新生血管，并逐漸將膜內(nèi)物質(zhì)降解、吸收，替換成為有宿主自體特征的細胞外組織基質(zhì)［6］。

本實驗中將ADM材料、Bio-gide膠原膜和人工骨替代物HA-TCP配合使用，充分利用了雙相磷酸鈣復合物良好的生物相容性、可降解性和骨引導活性［11］。分別于 GBR術(shù)后8、12周時觀察發(fā)現(xiàn)，B組(牛ADM)和C組(膠原膜)在組織學表現(xiàn)上較為類似，8周即可觀察到大量的新生骨小梁并伴有部分未骨化的纖維結(jié)締組織，12周時兩組的新生骨小梁數(shù)量均顯著增加。無論8周還是12周，各組的新生骨量均為C組最高，其次為B組，兩者間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);而 A組(豬ADM)的新生骨量則明顯低于B、C組，但 A、B、C組的新生骨量均明顯高于D、E組(P＜0.05)，其中E組最低。12周與8周相比，各組的新生骨量均有顯著增加(P＜0.05);但組織學觀察顯示，12周時的所有實驗組仍未形成完全成熟的致密骨板和哈弗系統(tǒng)，僅可見部分骨小梁融合和少量骨髓腔形成。

本結(jié)果表明，P-ADM、B-ADM、Bio-gide均能在GBR技術(shù)中發(fā)揮屏障膜作用，并促進兔顱骨缺損的骨組織再生和修復。其中牛脫細胞真皮基質(zhì)和膠原膜的成骨效果無明顯差異，但其促進和引導缺損區(qū)骨組織修復的遠期效果是否存在差異尚需進一步的實驗論證。

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