自噬對小鼠骨髓間充質干細胞干性標記基因的影響

雒可夫，劉文佳，陳吉華，金 巖

(陜西西安710032:1.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院修復科軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室;2.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院組織工程研究中心軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室)

當下，組織工程與再生醫(yī)學的迅猛發(fā)展，給口腔醫(yī)學帶來了新的變革和生機;隨著組織工程皮膚［1］、骨［2］和牙齒［3］等概念的提出及其部分相關產品的面世，更為口腔醫(yī)學的發(fā)展開辟了新的思路和空間。在組織工程和再生醫(yī)學研究中，種子細胞是其必要的條件之一，其中骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)因其具有的多向分化潛能［4］，且來源豐富、易于獲得等優(yōu)勢，常被作為組織工程的種子細胞，并越來越受到重視。

BMMSCs在自我更新、分化和衰老過程中，受到了多種機制的精細調控，其中一些胚胎干細胞標記物，如Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ等均與干細胞的自我更新、分化潛能等有著密切的關系［5］。有實驗［6］證實，增加Nanog和Oct-4在干細胞中的表達，能有效促進細胞增殖并增強其集落形成的能力，而這一現象又被認為與細胞干性的維持息息相關。

自噬是廣泛存在于真核生物中的一種細胞自我保護機制［7］，在這個過程中，細胞中冗余的細胞器、錯誤折疊的蛋白以及代謝過程中產生的廢物等，都可以被雙層脂質膜包裹而形成自噬小體，并經由溶酶體降解成可供細胞循環(huán)利用的氨基酸、甘油三酯等小分子。這種通過自噬的細胞自我保護機制可維持細胞的穩(wěn)態(tài)，并提高其在逆境下生存能力［8］。但是，自噬的活性也會隨著細胞的衰老而逐漸減弱，因此，自噬的活性水平也被認為是衡量細胞年輕態(tài)的重要指標。在對果蠅、酵母菌和秀麗線蟲等低等生物進行研究時發(fā)現，通過提高細胞的自噬水平，確實能延長其機體的平均壽命［9］。

正如很多文獻中報道的一樣，細胞的干性也會隨著衰老而逐漸退化，并開始喪失多向分化潛力，成骨、成脂效率減慢［10］。但目前尚未見將干細胞的自噬活動與細胞干性的維持相聯系起來的有關報道。本研究試圖通過改變小鼠BMMSCs的自噬水平，觀察其干性標記基因表達的差異，探討兩者之間的關系，以期為更好地維護BMMSCs在體外的良好狀態(tài)和分化潛能打下基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

C57BL/6小鼠(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供);α-MEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺(Gibco，美國);胎牛血清(杭州四季青);抗CD90.2、抗 CD29、抗 SCA-1、抗 CD31、抗 CD146、抗CD11b抗體(Biolegend，美國);Trizol Reagent(Life Technologies，美國);RNA逆轉錄試劑盒(TOYOBO)、相關基因引物(上海生物工程公司);SYBR-ⅡGreen熒光定量試劑(Takara，日本);PMSF試劑、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天);抗 beclin 1、抗 atg 7、抗 atg12、抗 LC-3 抗體、兔二抗、鼠二抗(Cell Signaling，美國);抗 β-Actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀);PVDF膜(DUPONT，美國);ECL免疫熒光發(fā)光試劑(上海七海生物);X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche，美國);RNA oligo(上海吉瑪基因);CO2恒溫孵箱(Forma，美國);YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus Optical，日本);流式細胞儀(Beckman-Coulter，美國);紫外分光光度儀(NanoDrop?ND-1000，美國);PCR擴增儀(BioMetra，德國);Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國);高速離心機(Kubota2100，日本);6孔、12孔培養(yǎng)板(Falcon，美國);9 cm直徑細胞培養(yǎng)皿(Corning，Lowell，美國);電泳儀、半干轉膜儀(BIO-RAD，美國);Tanon掃描分析系統(tǒng)(上海天能)。

1.2 小鼠BMMSCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 小鼠BMMSCs的分離和培養(yǎng)

取8～9周齡C57BL/6小鼠，脫頸處死后置于750 mL/L的乙醇中浸泡消毒10 min;超凈工作臺內解剖、分離出小鼠的股骨、脛骨，并剪去兩端骨組織;然后用裝有α-MEM培養(yǎng)液的1mL注射器沖出骨髓，并將其置于盛有10 mL α-MEM培養(yǎng)液(含200 mL/L胎牛血清以及100 U/mL青霉素、鏈霉素)的直徑為90 mm的塑料培養(yǎng)皿中，反復吹打至無肉眼可見的細胞團塊后，置于37℃、飽和濕度的50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天首次半量換液，而后每兩天1次半量換液;并用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。待貼壁細胞融合達80%～90%時，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次;用2.5 g/L胰酶37℃下消化3 min后，加入等體積α-MEM培養(yǎng)液終止反應，并以2.5×104/cm2的密度進行傳代。

1.2.2 小鼠BMMSCs的表型鑒定

取P3代小鼠BMMSCs，胰酶消化后制成密度為3.25×106/mL的細胞懸液，并分裝于EP管中(100 μL/管)。按照試劑公司說明書推薦的比例，分別在各管中添加抗CD90.2、抗CD29、抗SCA-1、抗CD31、抗CD146和抗CD11b抗體(設不加抗體的空白管作為對照)后，4℃條件下避光孵育1 h;然后離心收集細胞，并用PBS清洗兩遍;最后用200 μL PBS重懸細胞，流失細胞儀檢測標記抗體陽性細胞所占的百分比。

1.3 激活小鼠BMMSCs自噬的實驗觀察

1.3.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)和6孔板(5×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng) 12 h待細胞貼壁后，棄原液，并分別將12孔板和6孔板中的細胞各隨機分為兩組(實驗組和對照組);實驗組加入含雷帕霉素終濃度為20 nmol/L的α-MEM培養(yǎng)液，對照組加入常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用相差顯微鏡觀察各種細胞的形態(tài)變化，并分別檢測各組自噬相關基因mRNA和蛋白的表達水平。

1.3.2 RT-PCR檢測各自噬相關基因的表達水平

取上述培養(yǎng)24 h的12孔板，PBS清洗兩遍后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，并用RNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板、β-actin為內參，用RT-PCR儀分別檢測atg-7、atg-12、beclin 1、LC-3 mRNA的表達水平，每個樣本設3個復孔。反應體系如表1所示，反應條件嚴格按照產品說明，所用引物及其序列見表2。

表1 RT-PCR反應體系

表2 各自噬相關基因引物及其序列

1.3.3 Western-blot檢測各自噬相關基因的蛋白表達水平

取上述培養(yǎng)24 h后的6孔板，PBS沖洗兩遍后，每孔中各加150 μL含1%PMSF的細胞裂解液裂解細胞(-80℃冰箱反復凍融3次，冰浴超聲裂解)，并提取細胞總蛋白。用BCA試劑盒對蛋白進行定量后，取等量樣品以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質。電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，用50 g/L的牛血清白蛋白封閉液封閉2 h;分別滴加 atg-7、atg-12、beclin 1、LC-3、β-actin 一抗封閉過夜后，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h;ECL發(fā)光試劑顯色，利用Tanon掃描分析系統(tǒng)進行觀察，并記錄實驗結果。

1.3.4 激活小鼠BMMSCs后干性標記基因的表達

取上述培養(yǎng)24 h的12孔板，按1.3.2相同的操作步驟提取細胞總RNA，并用RT-PCR儀分別檢測實驗組和對照組細胞的各干性標記基因Nanog、Oct-4、Sox-ⅡmRNA 的表達水平。所用引物及其序列見表3。

表3 各干性標記基因引物及其序列

1.4 抑制小鼠BMMSCs自噬的實驗觀察

1.4.1 抑制自噬對自噬相關基因表達影響的觀察

1.4.1.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠 BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄原液，并將細胞隨機分為3組(實驗組、正常對照組和陰性對照組)。實驗組先用無雙抗的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，再用可靶向作用于beclin 1的si-RNA(小分子干擾RNA)對細胞進行轉染，具體方法如下:取RNA oligo和轉染試劑X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，按使用說明分別用 50 μL 無雙抗無血清的α-MEM培養(yǎng)液稀釋后，將兩者混合制成轉染復合物，常溫下孵育15 min后加入到實驗組各孔中，并使 RNA oligo的終濃度為100 nmol/L，轉染試劑的終濃度為250 nmol/L;然后在常規(guī)培養(yǎng)條件下進行轉染，8 h后更換普通α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，正常對照組加入常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液，陰性對照組僅含轉染試劑終濃度為250 nmol/L的常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液，分別按實驗組相同的條件進行培養(yǎng)，并于同一時間終止培養(yǎng)。因為本實驗的RNA oligo為小分子RNA，可靶向作用于beclin 1，并使之沉默，故將其簡寫為si-beclin 1，其 具 體 序 列 為 5＇GGCACAAUCAAUAAUUUCATTUGAAAUUAUUGAUUGUGCCT 3＇。

1.4.1.2 RT-PCR儀檢測各組自噬相關基因的表達水平

取上述不同處理后的各組細胞，用RT-PCR儀分別檢測 atg-7、atg-12、beclin 1、Lc-3 mRNA 的表達水平。所有操作步驟均同實驗1.3.2。

1.4.2 抑制自噬對干性標記基因表達影響的觀察

1.4.2.1 實驗分組和處理

取P1代小鼠BMMSCs接種于12孔板(3×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄原液并將細胞隨機分為自噬抑制組(si-beclin 1組)、自噬抑制后再激活組(si-beclin 1+Rapamycin組)、正常對照組和陰性對照組，分別按實驗1.4.1.1相同的方法對各組細胞進行相應的處理(兩實驗組用siRNA進行轉染，兩對照組用相應的對照培養(yǎng)液培養(yǎng))后，si-beclin 1+Rapamycin組再用含雷帕霉素終濃度為20 nmol/L的α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組均于同一時間終止培養(yǎng)，并收集細胞進行以下檢測。

1.4.2.2 PT-PCR儀檢測各組干性標記基因的表達水平

取上述處理結束后的各組細胞，并按實驗1.3.2相同的操作步驟提取細胞總RNA;然后用RT-PCR儀分別檢測各組細胞的干性標記基因 Nanog、Oct-4、Sox-ⅡmRNA表達水平。所用引物同表3。

1.5 統(tǒng)計學分析

科研成果轉化過程。包含狹義的轉化過程和廣義的轉化過程。狹義的轉化過程是專指課題研究結束成果形成后，從知識的文本報告狀態(tài)到生產、科研的應用狀態(tài)的實現過程。而廣義轉化過程是指整個科研活動過程及成果形成后，包括研究階段的轉化、成果形成階段的轉化和二次開發(fā)轉化。

2 結果

2.1 小鼠BMMSCs原代細胞的形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡觀察可見，原代培養(yǎng)的小鼠BMMSCs呈梭性或不規(guī)則的多邊形，可貼壁生長，并有若干集落形成，整體生長形態(tài)類似于漩渦狀;培養(yǎng)第10天時，細胞融合程度約為80% ～90%(圖1)。

圖1 小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)第10天時鏡下觀察

2.2 小鼠BMMSCs表型鑒定結果

流式細胞儀檢測顯示，P3代小鼠BMMSCs中CD90.2、CD29、SCA-1的陽性率分別為 97.4%、97.6%、83.5%;CD31、CD146、CD11b 的陽性率分別為2.9%、2.4%、5.6%(圖2)。

圖2 小鼠BMMSCs表面標記物流式細胞儀檢測結果

2.3 激活小鼠BMMSCs自噬后的觀察結果

2.3.1 細胞形態(tài)學觀察

小鼠 BMMSCs經20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)與對照組相比無明顯變化;未見細胞團縮、漂浮等情況(圖3)。

圖3 小鼠BMMSc經20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后相差顯微鏡觀察(×20)

2.3.2 各組各自噬相關基因表達水平的比較

RT-PCR檢測顯示，小鼠BMMSCs經20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，各自噬相關基因的表達水平均較對照組有所升高;其中beclin 1、atg-7和atg12升高顯著，與對照組相比均P＜0.05，而LC-3的表達變化不大，與對照組相比P＞0.05(圖4)。

圖4 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各自噬相關基因表達的變化

2.3.3 各組各自噬相關基因蛋白的表達水平比較

Western-blot檢測結果與RT-PCR基本一致，即實驗組的beclin 1、atg-7和atg-12蛋白的表達水平均高于對照組;而LC-3Ⅰ的表達變化不大，但LC-3Ⅱ的表達有所增加(圖5)。

圖5 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各自噬相關基因蛋白的變化

2.3.4 各組干性標記基因表達水平的比較

RT-PCR檢測結果顯示，小鼠 BMMSCs經20 nmol/L雷帕霉素刺激24 h后，各干性標記基因Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ mRNA的表達水平均明顯高于對照組(P﹤0.05)，其中以Sox-Ⅱ的表達增加最為明顯(圖6)。

圖6 雷帕霉素刺激后BMMSCs中各干性標記基因表達的變化

2.4 抑制小鼠BMMSCs自噬后的觀察結果

2.4.1 各組各自噬相關基因表達水平的比較

通過si-RNA轉染抑制小鼠BMMSCs自噬后(si-beclin 1實驗組)，各自噬相關基因的表達水平均明顯低于正常對照組和陰性對照(Negative Control，NC)組(P﹤0.05);而陰性對照組中各自噬相關基因的表達水平雖較正常對照組有所升高，但均無統(tǒng)計學差異(P﹥0.05)(圖7)。以上結果說明si-RNA轉染有效，并可以排除轉染試劑可能帶來的干擾。

圖7 si-beclin 1轉染后BMMSCs中各自噬相關基因表達的變化

2.4.2 各組各干性標記基因表達水平的比較

通過si-beclin 1轉染實驗抑制小鼠BMMSCs自噬后，各干性標記基因Nanog、Oct-4和Sox-ⅡmRNA的表達水平均明顯低于正常對照組和陰性對照組(P﹤0.05);用雷帕霉素對si-beclin 1轉染后的小鼠BMMSCs進行刺激，則可使各干性標記基因Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ mRNA的表達水平有所回升，但是除Nanog恢復到正常對照組的水平(P﹥0.05)外，其他各基因仍明顯低于兩對照組(P﹤0.05)(圖8)。

圖8 si-beclin 1轉染后BMMSCs中各干性標記基因表達的變化

3 討論

基于間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多向分化潛能，各種組織來源的MSCs都可以作為組織工程的種子細胞［11］，特別是骨髓來源的MSCs，因其取材簡單，來源豐富，且具有較好地免疫原性［12］，而受到廣泛地關注，臨床應用前景非常廣闊。但是，如何使BMMSCs在體外或宿主體內保持良好的細胞干性和相對健康的生長狀態(tài)，目前所能做的還很有限。當下組織工程血管化的問題還沒有得到很好地解決，在血管還未長入的前期移植階段，氧和營養(yǎng)物質不能通過血管輸送到內部區(qū)域，而且細胞代謝產生的廢物也不能有效地通過血管向外排送，位于支架內部的種子細胞如何應對這樣的不利處境，是橫亙在組織工程和再生醫(yī)學發(fā)展道路上的一道難題［13］。

但是在一些惡性腫瘤中，由于癌細胞瘋狂生長，血管內皮細胞不能及時在內部實質中形成微血管網絡，這時的腫瘤內部細胞也同樣處于營養(yǎng)物質和氧缺乏、代謝廢物累積的不利處境，雖然也有壞死灶的形成，但是最終并不妨礙瘤體的不斷生長［14］。針對上述現象進行研究發(fā)現，這些癌細胞都有著較高的自噬水平［15-16］。有鑒于此，本實驗希望夠通過激活BMMSCs的自噬來增進細胞的穩(wěn)態(tài)、促使細胞“年輕化”，提高細胞在逆境中的存活能力;并通過這一手段來維持細胞干性，支持細胞的自我更新和分化潛能。

本實驗所培養(yǎng)的小鼠BMMSCs經表型鑒定結果顯示，CD31、CD146和CD11b等陰性標記物表達很低，而相應的CD90.2、CD29和SCA-1等陽性指標均呈陽性表達［17］;結合形態(tài)學觀察和貼壁生長特性［18］，提示其均有較高純度和多向分化潛能。

雷帕霉素是目前較為公認的自噬激活劑［19］，本實驗以20 nmol/L的濃度作用于小鼠BMMSCs 24 h，對細胞的形態(tài)和生長均未產生明顯的影響。采用si-beclin 1靶向作用于beclin 1，并使之沉默，則可抑制BMMSCs的自噬活性，從方法上來說更具有專一性和安全性，且避免了不必要的干擾。

RT-PCR和 Western blot檢測結果顯示，用20 nmol/L的雷帕霉素刺激BMMSCs后，除Lc-3無明顯變化外，其他各自噬相關基因mRNA和蛋白的表達水平較對照組均有所升高。雖然Lc-3變化不明顯，但實驗組中Lc-3Ⅱ的表達則有所上升，而這種蛋白水平的Lc-3Ⅰ向Lc-3Ⅱ的轉化正是自噬啟動的標志之一，而這個過程是不涉及Lc-3基因水平表達的［20］。si-beclin 1的沉默結果也比較理想，陰性對照組中各自噬相關基因的表達水平雖較正常對照組略有上升，但差異并不顯著，從而排除了轉染試劑可能帶來的干擾。實驗組與正常對照組和陰性對照組相比，各干性標記基因Nanog、Oct-4和Sox-ⅡmRNA的表達水平均明顯下降，從基因水平上看達到了抑制BMMSCs自噬水平的目的。

本結果表明，小鼠BMMSCs的自噬水平與細胞干性標記基因之間存在著密切的聯系，當BMMSCs的自噬水平發(fā)生變化后，Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ各干性標記基因也隨之發(fā)生了同步的變化，特別是Sox-Ⅱ升高更明顯。當si-beclin 1抑制了小鼠BMMSCs的自噬活性之后，Nanog、Oct-4和Sox-Ⅱ的表達也同步下調;而再用雷帕霉素部分恢復受si-beclin 1抑制的自噬活性時，其干性標記基因的表達也有了明顯的回升。以上結果提示，在一定范圍內，激活BMMSCs的自噬可以有效提高干性標記基因的表達，但其具體機制還有待進一步的探索。

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