生草栽培對山核桃林地土壤養(yǎng)分及微生物多樣性的影響

錢進芳,吳家森,黃堅欽

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地， 臨安 311300； 2. 浙江省淳安縣林業(yè)局， 淳安 311700)

山核桃(CaryacathayensisSarg.)為胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬落葉喬木，11月至次年4月為休眠期，是中國特有的優(yōu)質(zhì)干果和木本油料樹種，主要分布在浙江和安徽兩省交界的天目山區(qū)，有著500多年的栽培歷史[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和山核桃價格的不斷攀升[2]，山核桃經(jīng)營的集約化程度越來越高，主要的措施包括去除林下灌木、雜草，翻耕土壤，施用化肥和除草劑等。高強度的集約經(jīng)營使林地生物多樣性降低，在冬季大片地表裸露，水土流失嚴(yán)重[3]，土壤質(zhì)量下降[4]。山核桃主要分布于土壤淺薄、巖石裸露、生態(tài)脆弱的石灰?guī)r山地，高強度經(jīng)營導(dǎo)致山核桃產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境問題日益嚴(yán)重。針對這些問題，相關(guān)學(xué)者開展了林下留養(yǎng)雜草、種植冷季型綠肥等，在一定程度上提高了林地土壤有機質(zhì)和改善山核桃林分冬季景觀[5-6]。

生草是一種完全型綠肥，美國、韓國和日本等國家都大力發(fā)展綠肥產(chǎn)業(yè)[7-8]，大量研究表明，生草栽培可提高土壤有機質(zhì)含量，改善土壤理化性狀，保水保肥，提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)，增加土壤微生物數(shù)量和多樣性，改善林地生態(tài)環(huán)境[9-15]。根據(jù)山核桃落葉樹種的生物生態(tài)學(xué)特點，為改良山核桃林地土壤，選擇冷季型綠肥對林地進行自然修復(fù)十分必要。大多學(xué)者對山核桃林地生草栽培研究多集中于果園生態(tài)環(huán)境方面[6,16]，且缺乏系統(tǒng)研究。

大量高強度經(jīng)營下的森林土壤常以土壤養(yǎng)分與物理性質(zhì)指標(biāo)來評價其土壤質(zhì)量演化規(guī)律，但隨著土壤長期大量施用化肥和除草劑，理化性質(zhì)已逐漸失去敏感性[17]，而具有早期預(yù)警作用的生物指標(biāo)被逐漸重視。在土壤生物指標(biāo)中最具有潛力的是土壤微生物多樣性[18]。土壤微生物多樣性是指土壤微生物在遺傳、種類和生態(tài)層次上的變化，即微生物群落的穩(wěn)定性。森林土壤長期高強度集約經(jīng)營使土壤微生物生物量和多樣性減少[19-21]。生草栽培是否有利于豐富山核桃土壤微生物多樣性，不同生草對土壤微生物功能多樣性是否有差異等問題尚未見報道，因此有必要探討山核桃林土壤質(zhì)量的綠肥恢復(fù)機制。本試驗通過在山核桃林下栽培不同生草，研究了不同生草栽培對山核桃林地土壤養(yǎng)分、微生物生物量碳的影響，采用Biolog Eco法研究土壤微生物功能多樣性的變化，以期為山核桃林地土壤管理、制定環(huán)境生物修復(fù)方案提供微生物學(xué)依據(jù)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 試驗地自然概況

試驗點位于浙江省臨安市昌化鎮(zhèn)迎豐村山核桃生態(tài)示范園區(qū)，地理位置為30°03′02″N，119°08′54.2″E，海拔211 m，坡度30°，北坡，樹齡20—25a，平均密度600 棵/hm2。土壤類型為石灰土。屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，具有春多雨、夏濕熱、秋氣爽、冬干冷的氣候特征，全年降雨量1628.6 mm，年平均氣溫16.4 ℃，年降水日為158 d。

1.2 試驗設(shè)計

2010年9月在昌化鎮(zhèn)迎豐村山核桃示范園區(qū)布置生草栽培試驗，共設(shè)6個處理，分別是白三葉 (Trifoliumrepens)，1年生黑麥草 (Loliummultiflorum)，紫云英 (Astragalussinicus)，油菜(Brassicacampestris)，自然雜草(園區(qū)內(nèi)自然生長的雜草，主要為狗牙根、看麥娘、雀稗)，以傳統(tǒng)清耕作業(yè)(4、8月上旬噴施20%百草枯水劑375 kg/hm2進行除草)為對照，山核桃采收后將生草播種于山核桃林下，播種方式為撒播，播量平均為30 kg/hm2。采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，每種處理設(shè)3次重復(fù)，每個小區(qū)面積為10 m×7 m。生草方式為全園生草，連續(xù)2a播種，各小區(qū)水肥管理保持一致，4月和8月施肥兩次。肥料為農(nóng)家有機肥，平均每棵山核桃施肥10—15 kg。

1.3 樣品采集與處理

2012年4月中旬(生草旺盛生長時期)采用五點采樣法采集各處理0—20 cm的土樣，去除土壤中的石塊和植物，過2 mm篩，混勻，用四分法分成兩部分，一部分鮮土樣立即測定土壤微生物量碳和微生物功能多樣性，另一部分自然攤晾，風(fēng)干后用于土壤養(yǎng)分測定。

1.4 土壤養(yǎng)分測定

土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法；水解氮采用堿解擴散法；全氮采用凱氏定氮法；有效磷采用Bray法，鹽酸-氟化銨溶液浸提、鉬銻抗比色法；速效鉀采用乙酸銨浸提，原子吸收法；土壤全磷、全鉀采用硝酸-高氯酸-氫氟酸消煮法[22]。

1.5 土壤微生物生物量碳和微生物群落功能多樣性測定

土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸，用0.5 mol/L K2SO4溶液浸提，提取液用TOC-VCPH有機碳分析儀測定[17]。土壤的微生物代謝活性和功能多樣性采用Biolog Eco檢測法[21,23]。實驗步驟為：稱取相當(dāng)于10.0 g烘干土壤重量的新鮮土壤，加入裝有100 ml 無菌蒸餾水的三角瓶中，封口后置于搖床振蕩30 min(250 r/min)，得到土壤微生物懸浮液，靜止15 min后取上清液，在超凈工作臺中，用無菌水將其濃度稀釋到10-3，用8孔加樣器將稀釋好的土壤懸浮液加到Biolog Eco生態(tài)板(ECO MicroPlant, 美國Marix Technologies Corporation)中，每孔125 μL。將接種好的Eco板置于25 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d；每隔24 h用Biolog微平板讀數(shù)儀進行吸光值的測定，測定波長為590 nm。

1.6 Biolog數(shù)據(jù)處理方法[24-25]

土壤微生物代謝活性采用每孔顏色平均變化率(AWCD)來表示。對Biolog Eco 板培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Shannon多樣性指數(shù)(H)和均勻度指數(shù)(E)來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性。計算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/31

(1)

H=-∑PilnPi

(2)

E=H/lnS

(3)

式中,Ci為除對照孔外各孔在590 nm下的吸光值，R為對照孔A1的吸光值，Ci-R小于0的孔，計算中記為0；Pi第i孔的相對吸光值與整板相對吸光值總和的比率；S為Eco板顏色變化的孔的數(shù)目。

實驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS18.0，Excel 2007和DPS 7.05，所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生草栽培對山核桃林土壤養(yǎng)分的影響

由表1可以看出，6種不同處理的山核桃林地土壤有機質(zhì)、水解氮、速效鉀、有效磷、全氮、全鉀和全磷含量均存在不同程度的差異。白三葉栽培處理的土壤水解氮、速效鉀和有效磷均為最高，分別達(dá)到224.14、91.67和16.37 mg/kg，分別較清耕提高了41.4%、149.9%和85.8%；其次為紫云英處理，分別為212.45、59.17和14.79 mg/kg；黑麥草、油菜和自然雜草處理土壤水解氮、速效鉀和有效磷差異不明顯。

從全量含量分析可知(表1)，生草栽培對山核桃林地土壤均有較好的改良效果，白三葉、油菜和紫云英處理的全氮和全磷含量均較高，與清耕處理相比，達(dá)到5%水平差異，而白三葉和紫云英處理的全鉀含量最低，顯著小于清耕處理，這可能是由于豆科牧草在表土層與山核桃根系存在養(yǎng)分競爭所導(dǎo)致；其中白三葉處理的全氮含量最高，為2.28 g/kg，比清耕處理提高了36.5%；油菜處理的全鉀含量最高，為9.80 g/kg，比清耕提高了6.7%；紫云英處理的全磷最高，為0.294 g/kg，相較于清耕提高了75.0%，漲幅明顯。自然雜草處理的效果好于黑麥草處理，黑麥草處理全鉀和全磷與清耕相比無明顯差異。

白三葉、黑麥草、紫云英處理的土壤有機質(zhì)含量均高于清耕對照，差異明顯，達(dá)顯著水平。其中白三葉和紫云英提高效果最明顯，分別為38.68、37.72 g/kg，比清耕分別提高了35.1%和31.7%，漲幅明顯高于其他處理。自然雜草處理與清耕處理無顯著差異，這主要是自然雜草在林中生長不佳，生物量較小，因而歸還的有機物料也較少?？梢娚胶颂伊值剡M行生草栽培能顯著提高土壤肥力，改善土壤養(yǎng)分狀況。

表1 不同生草栽培對土壤 (0—20 cm) 養(yǎng)分含量的影響(播種2a)

同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 不同生草栽培對山核桃林土壤微生物生物量碳的影響

微生物生物量碳(MBC)是土壤有機碳庫中非?；钴S的組分，近幾年來被認(rèn)為是反映土壤質(zhì)量變化的重要指標(biāo)之一，已有研究顯示地上植被類型不同，其土壤微生物生物量碳差異明顯[22]。通過2年生草栽培，分析測定了山核桃林地土壤微生物生物量碳。從圖1可以看出，不同生草栽培處理土壤MBC均顯著高于清耕，說明生草栽培能使山核桃林地土壤微生物特性明顯改善。研究發(fā)現(xiàn)，白三葉處理土壤MBC最高，相比較于清耕，提高了169.6%；其次為黑麥草、紫云英和油菜，但處理間差異不顯著，分別較清耕提高了159.6%，144.1%和138.6%；自然雜草處理土壤MBC較低，僅為166.4 mg/kg，較清耕提高了58.6%。

圖1 不同生草栽培對土壤微生物生物量碳的影響

2.3 不同生草栽培對山核桃林土壤微生物AWCD的影響

從圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理的AWCD值呈拋物線模式。不同處理的土壤微生物活性都隨時間的增加而提高。6種不同處理土壤的AWCD在24 h內(nèi)無明顯變化，在24 h后快速上升，在144 h達(dá)到最大值后逐漸減慢，保持穩(wěn)定。比較所有處理，白三葉處理效果最好，在所有培養(yǎng)時間內(nèi)均高于其他處理，當(dāng)達(dá)到144 h后，其微生物活性略有減??；其次是紫云英處理；清耕處理的土壤微生物群落功能多樣性最差；黑麥草、油菜和自然雜草處理間無顯著差異，但較清耕處理效果明顯。說明生草栽培能改善林地土壤的微生物特性。結(jié)合土壤養(yǎng)分分析，可知豆科植物無論是在提高土壤肥力還是改善土壤微生物特性上，效果均優(yōu)于禾本科植物。

圖2 不同生草栽培土壤微生物AWCD隨培養(yǎng)時間的變化

2.4 不同生草栽培山核桃林土壤微生物主成分分析

利用培養(yǎng)96 h后測定的吸光度值為數(shù)據(jù)，運用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)。

31個主成分因子前9個的累積方差貢獻率達(dá)到86.96%，其中前3個較大的主成分方差貢獻率為33.20%、11.51%和10.62%。從中提取可以聚集為單一碳源變量的數(shù)據(jù)變異(累積方差貢獻率)為44.71%的前2個主成分(PC1、PC2)來進行微生物群落功能多樣性分析。結(jié)果表明(圖3)，不同處理在PC軸上出現(xiàn)了明顯的分異，PC1將白三葉處理和清耕處理與其他處理區(qū)分開來，且白三葉處理處于PC1的最正端，清耕(對照)處理處于PC1的負(fù)端。油菜和自然雜草處理在PC1軸上距離較大，且各有1個重復(fù)與其他2個重復(fù)的距離較遠(yuǎn)。紫云英處理在PC1軸上的主成分值為-2—2，在PC2軸上為-1—-5。黑麥草處理在PC1和PC2軸上差距均較大，3個重復(fù)的距離較遠(yuǎn)。

圖3 不同生草栽培土壤微生物碳源利用率的主成分分析

2.5 不同生草栽培山核桃林土壤微生物多樣性指數(shù)比較

不同生草處理間土壤微生物多樣性指數(shù)存在一定的差別(表2)。Shannon指數(shù)大小順序為白三葉>自然雜草>油菜>紫云英>黑麥草>清耕，白三葉處理的Shannon指數(shù)最高，為3.786；清耕最低，為3.335；油菜、紫云英和自然雜草處理的Shannon指數(shù)都很高，但三者之間差異不顯著(P>0.05)。

對不同處理而言，土壤微生物均勻度指數(shù)存在不同程度的差異。均勻度指數(shù)大小的順序為白三葉>紫云英>油菜>自然雜草>黑麥草>清耕，白三葉、油菜和紫云英均勻度指數(shù)較高，分別為0.980、0.969和0.972，但三者之間未達(dá)到顯著差異，自然雜草處理的均勻度指數(shù)為0.965，黑麥草的均勻度指數(shù)較低，為0.936；清耕處理最低，為0.933。相較于清耕，白三葉的Shannon多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均為最高，黑麥草的兩指數(shù)均為最低，油菜、紫云英和自然雜草處理三者間無論是多樣性指數(shù)還是均勻度指數(shù)差異均未達(dá)顯著水平。

2.6 不同生草栽培土壤微生物多樣性與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系

將96 h每孔平均顏色變化率AWCD值、微生物Shannon指數(shù)(H′)、均勻度指數(shù)(E)與土壤各肥力指標(biāo)進行相關(guān)分析，如表3所示，96 h AWCD值、微生物Shannon指數(shù)(H′)、均勻度指數(shù)(E)兩兩之間均達(dá)到了極顯著相關(guān)(P<0.01)，AWCD和Shannon指數(shù)與有機質(zhì)、有效磷兩指標(biāo)達(dá)到了顯著相關(guān)(P<0.05)，與其余肥力指標(biāo)之間雖未達(dá)到顯著相關(guān)，但都存在正相關(guān)關(guān)系。土壤各肥力指標(biāo)之間均達(dá)到顯著或極顯著相關(guān)。

表2 不同生草栽培土壤微生物功能多樣性指數(shù)(96 h)

同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

表3 不同生草栽培土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物功能多樣性的相關(guān)關(guān)系

*P<0.05 **P<0.01

3 討論

本試驗通過常規(guī)分析方法、氯仿熏蒸法和Biolog-Eco法對不同生草栽培處理下山核桃林地土壤養(yǎng)分、土壤微生物生物量碳和土壤微生物多樣性進行了研究，試驗結(jié)果顯示，相較于清耕處理，生草栽培能明顯提高土壤肥力，改善土壤養(yǎng)分狀況。有研究認(rèn)為，生草栽培對土壤肥力有顯著改善，增加土壤養(yǎng)分和有機質(zhì)含量[10, 26-27]。栽培生草后土壤環(huán)境與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致土壤通氣性、水勢梯度和熱傳導(dǎo)性隨之改變，為微生物創(chuàng)造了適宜的生存和繁殖條件，同時刈割生草覆蓋后，生草的腐爛物為林地土壤微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，更適合微生物的繁殖[28]。微生物的大量繁殖促進了土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，加之生草與土壤微生物及其他生物的作用，轉(zhuǎn)化為可供吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，提高土壤養(yǎng)分含量。種植生草每年通過凋落物歸還，細(xì)根周轉(zhuǎn)和根系分泌等可向土壤歸還大量的有機質(zhì)，而清耕則造成土壤有機質(zhì)的加速分解，同時失去地被層的保護，水土流失嚴(yán)重。本研究與前人結(jié)果基本一致。

土壤微生物生物量碳是土壤中活的有機質(zhì)成分，可作為衡量土壤肥力及質(zhì)量變化的重要指標(biāo)。毛竹林地播種綠肥能明顯增加土壤微生物生物量碳的含量，表現(xiàn)為白三葉>大綠豆>黑麥草>黑麥草、白三葉和大綠豆混播>對照[29]。種植不同牧草對復(fù)墾紅壤土壤根際微生物量碳發(fā)生了顯著變化，為黑麥草+三葉草>三葉草>黑麥草>未種植土壤，處理間差異達(dá)顯著水平[30]。本研究結(jié)果表明所有生草處理土壤微生物生物量碳含量均明顯高于清耕，白三葉處理最好，其次為黑麥草、油菜和紫云英處理，但處理相互間無顯著差異，自然雜草處理較差。

Biolog法在土壤微生物群落多樣性的研究中應(yīng)用較為廣泛[25, 31-33]，所得微生物功能多樣性特征與土壤基本特征都能建立較好的聯(lián)系。本文通過Biolog Eco法研究了山核桃林地不同生草栽培的土壤微生物多樣性，結(jié)果顯示，不同生草處理的微生物活性(AWCD)、土壤微生物Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)均有一定的差異，生草處理的土壤微生物活性和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù))顯著高于清耕。土壤微生物活性(AWCD)以白三葉處理最高，清耕處理最低；紫云英、黑麥草、油菜和自然雜草4種處理相互間差異不顯著，但均高于清耕處理；Shannon指數(shù)大小順序為白三葉>自然雜草>油菜>紫云英>黑麥草>清耕(對照)，均勻度指數(shù)大小的順序為白三葉>紫云英>油菜>自然雜草>黑麥草>清耕(對照)。地上植物種類組成，植物殘體、根的生物量、根系分泌物和土壤理化性質(zhì)等可能是導(dǎo)致這種差異的主要原因[34]。之所以白三葉處理的土壤微生物功能多樣性會高于其他生草處理，這可能是因為白三葉為多年生草本，根系發(fā)達(dá)，播種后能快速生長，迅速郁蔽地面，且終年不枯，種子成熟后，自然脫落，可于第二年更新，不需復(fù)播。白三葉植物根際釋放大量的碳源，較高濃度的碳源促進了土壤微生物群落代謝活性的提高[35]。

本研究表明，不同生草處理的土壤微生物AWCD、微生物Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)兩兩之間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與土壤養(yǎng)分各指標(biāo)之間存在正相關(guān)關(guān)系。這與安韶山等對寧南山區(qū)9種典型植物土壤AWCD、微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)兩兩之間均達(dá)到極顯著相關(guān)類似[25]。

4 結(jié)論

不同生草栽培處理的土壤養(yǎng)分、微生物生物量碳、土壤微生物活性(AWCD)、Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)存在不同程度的差異。相較于清耕處理，生草栽培處理的土壤有效元素和全量元素含量均明顯增加。土壤養(yǎng)分分析中，白三葉和紫云英處理較優(yōu)，黑麥草處理較差。

生草栽培可以明顯增加土壤微生物生物量碳含量，白三葉處理最高，與清耕相比，提高了169.6%，其次為黑麥草、紫云英和油菜，分別較清耕提高了159.7%，144.1%和138.6%，但三者間無顯著差異，自然雜草處理較低，僅為166.37 mg/kg，較清耕提高了58.6%。

不同生草處理的土壤微生物對相同碳源的利用、對碳源消耗量及速率上的差異，表明其代謝強度不同；不同處理的土壤每孔顏色變化率AWCD為白三葉>紫云英>油菜>自然雜草>黑麥草>清耕。不同處理的土壤Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)，白三葉最高，清耕最低；兩指數(shù)在不同處理間具有一致性。96 h平均顏色變化率(AWCD)、Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)兩兩之間均達(dá)到了極顯著相關(guān)，與土壤肥力指標(biāo)之間存在正相關(guān)關(guān)系。

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