寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄生長的影響及對灰霉病的防治作用

趙 建,黃建國,*,袁 玲, 時安東,杜如萬,刑小軍

(1. 西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400716； 2. 四川省涼山州煙草公司，西昌 615000)

隨著我國城市規(guī)模的不斷擴張，菜地資源日益減少，蔬菜連作現(xiàn)象十分普遍，病害發(fā)生嚴重。番茄灰霉病是由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers. 侵染引起的真菌病害，發(fā)病面積大、危害嚴重，番茄產量損失可達30%以上[1- 2]。目前，生產中缺乏高抗灰霉病的番茄品種[3]，病害防治一直依賴化學藥劑，但長期連續(xù)施用導致灰葡萄孢容易產生抗藥性，常用的多菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈等苯并咪唑類等農藥的防治效果已顯著降低。此外，大量使用化學農藥不僅影響番茄果實的安全性，危害人體健康，而且還造成嚴重的環(huán)境問題[4- 5]。所以，研制高效、穩(wěn)定、安全的生物農藥，防治番茄灰霉病很有必要。

寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)屬卵菌門(Heterokontophyta)，腐霉科(Pythiaceae)，腐霉屬(Pythium)，能有效抑制灰葡萄孢Botrytiscinerea、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum和黑脛病菌Phytophthoranicotiana等多種植物病原真菌的生長繁殖[6]。研究表明，寡雄腐霉抑菌的主要機理是寄生、抗生和競爭等作用[7]，田間單獨接種寡雄腐霉還能誘導植物抗病性[8]，促進植物生理代謝和刺激生長[9]。目前，歐美發(fā)達國家已制備出對人畜無毒安全，無環(huán)境殘留的寡雄腐霉卵孢子制劑，用于蔬果的生產與保鮮[10- 11]。但是，在大田應用孢子活菌劑時，生防效果依賴于卵孢子的萌發(fā)和菌絲生長繁殖，常受溫度、濕度、光照(尤其是紫外線強度)、降雨、土壤、農藝(施肥、耕作、化學農藥)等多種自然或人為因素的影響，故防病效果不佳，穩(wěn)定性差[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，寡雄腐霉能產生寡雄蛋白和抗菌物質等多種次生代謝物[6]。因此，直接利用寡雄腐霉的次生代謝產物可避免人為和環(huán)境因素對活菌生長繁殖和分泌次生代謝產物的影響，既可提高防病效果，又能克服微生物活體菌劑效果不穩(wěn)定的常見缺陷。為此，本研究利用自主分離獲得的寡雄腐霉優(yōu)良菌株，制備發(fā)酵液，研究該發(fā)酵液對番茄植株生長的影響和對灰霉病的防治作用，并在大田生產中進行生防效果驗證，旨在為研發(fā)防效好而穩(wěn)定的番茄灰霉病生防制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種為佳粉15號；番茄灰霉病菌由西南大學植物保護學院提供；寡雄腐霉發(fā)酵菌株P.oligandrumCQ2010(PoCQ2010)從種植番茄的土壤中自主分離獲得，保存于西南大學資源環(huán)境學院微生物實驗室。取60 g玉米粉，80 ℃水浴2 h，過濾，濾液加15 g葡萄糖，定容至1 L，pH值調至6.0，1000 mL三角瓶裝液量500 mL，滅菌得玉米汁培養(yǎng)液，然后接種寡雄腐霉菌株，搖床培養(yǎng)7 d，(301) ℃、150 r/min，用200m的濾膜真空抽濾制備寡雄腐霉發(fā)酵液，-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。預備試驗中，寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄灰霉病菌絲生長的抑制率達78.6%，對灰霉病菌的孢子萌發(fā)的抑制率達51.2%。

1.2 試驗設置

盆栽試驗于2011年3月2日至7月10日在西南大學溫室盆栽場進行。在番茄生長季節(jié)，采集重慶市典型、具有代表性的灰棕紫泥紫色土耕作層(0—20 cm)。土壤基本理化性質：質地中壤，pH值7.1，有機質10.79 g/kg，全氮0.78 g/kg，全磷0.42 g/kg，全鉀20.54 g/kg，堿解氮28.34 mg/kg，有效磷10.91 mg/kg，有效鉀153.2 mg/kg。將揀去石礫和植株殘體等雜物的土壤晾干，高壓蒸汽滅菌后備用。播種前每盆裝土2.5 kg，以硝酸銨、過磷酸鈣和硫酸鉀作基肥，每千克土壤分別施入氮 200 mg、磷 100 mg、鉀200 mg。

每盆移栽株高10 cm 左右的番茄幼苗2株，常規(guī)栽培20 d。選擇60盆長勢一致的番茄植株進行試驗處理，每組30盆，一組接種灰霉病菌，用B.C表示；另一組不接種灰霉病菌(對照)，用CK表示。在多云無風的天氣條件下：①每組各取15盆，噴施高溫滅菌的培養(yǎng)液，以葉面上附有細密液滴但不流淌為宜，簡稱“培養(yǎng)液”，用A表示；②另15盆用寡雄腐霉發(fā)酵液噴施，簡稱“發(fā)酵液”，用B表示。噴施24 h后，對B.C組采用毛筆涂抹法接種灰霉病菌(孢子濃度約為1×105個CFU/mL)，保濕48 h[13]。由此形成整4個處理：①接病菌+培養(yǎng)液(B.C +A)；②接病菌+發(fā)酵液(B.C+B)；③不接病菌+培養(yǎng)液(CK +A)；④不接病菌+發(fā)酵液(CK+B)。按盆栽試驗的常規(guī)方法，澆水、除草等管理番茄幼苗。

田間試驗于2012年3月12日至7月10日在重慶市北碚區(qū)璧山縣番茄種植基地日光溫室中進行，以具有代表性的灰棕紫泥為供試土壤，田間種植當?shù)氐闹髟苑哑贩N(約2000 株)，研究了寡雄腐霉發(fā)酵液對灰霉病的防治作用。試驗設置3種處理：①寡雄腐霉發(fā)酵液(T1)；②化學農藥腐霉利(T2)；③清水(CK)，施藥間隔期30 d(3月至7月)，施藥量800 L/hm2，每處理重復3次，每個處理小區(qū)面積38.95 m2約200株，隨機區(qū)組排列，并常規(guī)管理大田番茄植株。

1.3 測定項目與方法

1.3.1寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄植株生長的影響

盆栽試驗處理后35 d，收獲番茄植株。先稱取生物量，再隨機選10個成熟功能型葉片，用打孔器取樣，丙酮提取-分光光度法測定葉綠素含量[14]，并選取新鮮須根，用TTC法測定根系活力[14]。然后，將植株105 ℃殺青后(80±2) ℃烘干，常規(guī)分析氮、磷、鉀含量[15]。

1.3.2寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果

盆栽試驗中，處理后第10天調查、統(tǒng)計番茄植株發(fā)病率和病情指數(shù)；大田試驗中，調查各個小區(qū)最后一次施藥10 d后灰霉病引起的病果率，計算防治效果。番茄灰霉病的分級標準及藥效計算方法按照《農藥田間藥效試驗準則》進行[16]。

1.3.3 番茄葉片病理指標測定

盆栽試驗處理后第1、4、7、10、13天，分別隨機選取5個成熟功能型葉片，用打孔器取樣，電導法測定細胞膜透性[17]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[18]。并在第10天采集樣葉，稱取0.5 g，加石英砂和PBS 溶液(pH值7.8)冰浴勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心，收集上清液。測定超氧化物歧化酶活性(SOD)和苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)[19]；多酚氧化酶活性(PPO)[20]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用DPS v6.50統(tǒng)計軟件處理，并采用LSD法檢測處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄植株生長的影響

2.1.1 生物量

圖1可見，盆栽試驗中，在不接種病菌的條件下，施用寡雄腐霉發(fā)酵液顯著促進番茄植株生長，總生物量提高了9.5%。其中，地上部生物量分別為34.29 g/株(對照)、36.64 g/株(發(fā)酵液)，提高了6.9%；根系生物量分別為15.05 g/株(對照)、17.37 g/株(發(fā)酵液)，提高了15.4%。

圖1 番茄植株生物量

2.1.2 葉綠素含量和根系活力

從圖2中可以看出，盆栽試驗中，在不接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液的處理葉綠素含量最高為1.18 mg/g，比施用培養(yǎng)液的處理顯著提高了21.6%，根系活力比施用培養(yǎng)液的處理也提高了14.4%。但是，在接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液對葉綠素含量和根系活力沒有顯著影響。

2.1.3 植株養(yǎng)分含量與吸收量

由表1可知，盆栽試驗中，在不接種病菌的條件下，施用寡雄腐霉發(fā)酵液促進番茄植株吸收養(yǎng)分，氮、磷、鉀吸收量分別增加了8.0%，12.3%，13.6%；在接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液顯著提高番茄植株吸收氮素，但對磷、鉀吸收量無顯著影響。

圖2 番茄葉片葉綠素含量與根系活力

表1 不同試驗處理對番茄植株的養(yǎng)分含量與吸收量的影響

2.2 寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果

從表2可知，盆栽試驗中，在不接種病菌的處理中，番茄植株未發(fā)生灰霉病。在接種病菌的處理中，施用培養(yǎng)液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為75.7%和43.3；施用寡雄腐霉發(fā)酵液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為32.4%和17.2，發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了57.2%和60.3%，相對防治效果達到60.3%。大田試驗中，施用寡雄腐霉發(fā)酵液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為29.8%和11.3，發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了59.0%和71.2%，相對防治效果達到71.2%。

表2 寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果

2.3 寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄植株病理指標的影響

2.3.1 細胞膜透性和丙二醛含量

圖3可見，盆栽試驗中，接種病菌顯著提高番茄葉片細胞膜透性，且隨時間的延長而增加，其平均值分別為31.0%(接種后第4天)、40.2%(接種后第7天)、47.0%(接種后第10 天)、53.4%(接種后第13天)，但是，在不接種病原菌的處理中，葉片細胞膜透性無顯著變化。值得注意的是，接種病菌后，施用發(fā)酵液顯著降低葉片細胞膜透性，分別比培養(yǎng)液降低了24.8%(接種后第7天)、14.0%(接種后第10天)、16.6%(接種后第13天)；若不接種病原菌，在培養(yǎng)液和發(fā)酵液之間，葉片細胞膜透性無顯著差異。

在番茄葉片中，丙二醛含量的變化類似細胞膜透性，即接種病原菌提高葉片丙二醛含量，且隨處理時間的延長而增加，施用發(fā)酵液顯著降低接種病原菌葉片的丙二醛含量；相反，在不接種病原菌的處理中，葉片丙二醛含量無顯著變化，施用發(fā)酵液和培養(yǎng)液之間無顯著差異。

圖3 不同試驗處理對番茄葉片細胞膜透性和丙二醛的影響

2.3.2 抗病相關酶活性

由表3可知，盆栽試驗中，接種病菌顯著提高番茄葉片中的SOD、PPO、PAL活性，其平均值分別提高了12.9%、84.0%、36.0%。在接種病原菌的處理中，施用發(fā)酵液顯著提高了PPO和PAL活性，分別提高了35.8%和41.4%， 但對SOD無顯著影響。在不接種病原菌的處理中，施用發(fā)酵液對SOD、PPO、PAL活性無顯著影響。

表3 不同試驗處理對番茄葉片SOD、PPO和PAL活性的影響

3 討論

一般而言，化學農藥干擾動物代謝，不同程度地危害人畜健康，有些化學農藥還能產生致病、致癌、致變等作用，逐步由使用化學農藥過度到安全無毒的生物防治是植物病蟲害防治的目標之一。目前，我國植物病蟲害防治的主要手段仍然是化學藥劑。幾十年來，盡管做了大量的研究工作，但完全可以代替化學殺菌劑的生物農藥還不多，研制高效、安全、無毒的新型生物農藥很有必要。

研究發(fā)現(xiàn)，目前各國應用較廣泛的生防菌木霉有很強的根際定殖能力，能產生多種次生代謝產物，提高葉綠素含量、促進氮和礦物元素吸收，改善植物營養(yǎng)；與根系微生物相互作用，抑制多種病原菌生長；誘導辣椒、馬鈴薯、萵苣、黃瓜、白菜、豌豆、花生、長春花和菊花等多種作物產生抗病性，具有防病促生效應[12]。與之類似，生防菌寡雄腐霉卵孢子接種于黃瓜和胡椒根際，能改善它們的磷素營養(yǎng)，增加植物體內的吲哚乙酸(IAA)含量[9]，促進植物的生長。一般而言，有益微生物促進植物生長的現(xiàn)象常常與微生物產生生長素和相關次級代謝物的合成具有密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)，寡雄腐霉產生大量色胺TNH2，當寡雄腐霉在培養(yǎng)基中生長的時候，還有一些植物生長素前體，包括色氨酸Trp和吲哚乙酸IAAld，都表明寡雄腐霉產生色胺類生長素復合物[21]。此外，寡雄腐霉還能分泌抗菌物質[10]、擬激發(fā)子蛋白[21]、類毒素物質色胺等[22]，它們細胞壁中的蟹殼素、葡聚糖、細胞壁蛋白等，都能保護和誘導多種蔬菜產生系統(tǒng)抗病性[11]，如誘導小麥、甜菜、番茄對絲核菌R.solaniAG2- 2、番茄枯萎病(F.oxysporumf.sp.radicis-lycopersici)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抗性反應[23]。研究還發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)寡雄腐霉菌絲，勻漿后也能誘導番茄對青枯菌的抗性[24]。據(jù)報道，施用寡雄腐霉卵孢子防病效果介于0—74.5%之間，促進生長的作用也不甚穩(wěn)定[11]，進一步提高其防效很有必要。在本試驗中，利用寡雄腐霉優(yōu)良菌株制備內含次生代謝產物、具有生防作用的發(fā)酵液，噴施健康和感病的番茄植株。結果表明，健康植株施用寡雄腐霉發(fā)酵液后，葉綠素含量和根系活力提高，有益于增強光合作用，增加氮、磷、鉀養(yǎng)分吸收，促進植株生長；感病植株施用寡雄腐霉發(fā)酵液后，有效降低了番茄灰霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)。因此，寡雄腐霉發(fā)酵液不僅可以穩(wěn)定有效的防治番茄灰霉病，還能促進番茄植株的生長，與生防菌木霉等有相同的生物學效應。

植物受到病原菌侵染時會產生大量的活性氧，多余的活性氧會影響植物的正常生理活動，膜脂過氧化形成丙二醛等過氧化產物，從而不同程度地破壞細胞膜的完整性，膜透性增加、選擇透性降低、胞內電解質外滲，環(huán)境介質的電導率增加[25]。番茄植株接種灰霉病菌后，膜透性和丙二醛含量增加，但施用發(fā)酵液降低細胞膜透性和丙二醛含量，說明寡雄腐霉發(fā)酵液中的次生代謝產物直接或間接地增強了植株抗性或減輕了灰霉病對番茄植株細胞膜等造成的傷害。

在病原菌、生防菌、植株三者相互作用過程中，生防菌可作為植物激活劑，誘導植物系統(tǒng)獲得抗病性(ISR)，與病原物誘導的植物系統(tǒng)獲得抗性(SAR)基本類似。ISR的作用機制主要是通過組織木質化，增強細胞機械屏障和產生植保素，它們涉及到苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)與超氧化物歧化酶(SOD)等催化的生物化學過程，對于抵抗真菌、細菌和病毒，保護植物免受疫病危害，促進作物生長，彌補損失，減輕病害程度有重要作用[26]。在病原菌誘導防御反應研究中，有研究曾報道，番茄植株對細菌性潰瘍病Pseudomonassyringae的抵抗力與PPO活性呈顯著正相關，抗性強的品種PPO活性顯著高于敏感品種[27]。PAL和POD的活性與串珠鐮刀菌引起玉米對穗粒腐病抗性呈負相關，而與丙二醛含量的變化呈正相關[28]。在生防菌次生代謝產物提高植物抗病能力的研究中，李頌等也研究發(fā)現(xiàn)，施用黑曲霉次生代謝產物，可顯著提高番茄植株體內SOD、PPO、PAL等防御性相關酶的活性[30]；在海洋芽孢桿菌B- 9987的無細胞濾液中，所含的活性物質對茄鏈格孢菌和灰葡萄孢具有良好的生防作用[30]。在本試驗中，番茄植株接種灰霉病菌后，SOD、PPO和PAL活性提高，施用寡雄腐霉發(fā)酵液進一步提高了SOD、PPO和PAL活性，說明灰霉病菌能誘導番茄植株產生抗性反應，寡雄腐霉發(fā)酵液同樣也能提高保護酶和防御酶的活性，促進合成抗性物質，構成保護性屏障，協(xié)同抗病，從而提高番茄植株的抗病能力，防止病原菌入侵，減輕病原菌產生的傷害作用。

總之，寡雄腐霉發(fā)酵液不僅能有效防治番茄灰霉病，而且還具有促進番茄生長的作用，顯著不同于只具有防病治病作用的生防制劑，進一步開展深入研究，可望制備出高效、穩(wěn)定、安全兼具防病促生的生物農藥。

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