北太平洋柔魚微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及遺傳多樣性

劉連為，陳新軍,2,3,*，許強(qiáng)華,2,3，李偉文

(1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院， 上海 201306； 2. 國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3. 上海海洋大學(xué)大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

柔魚(Ommastrephesbartramii)廣泛分布于全球溫帶、副熱帶海域，目前被規(guī)模性開發(fā)利用的海域主要在北太平洋[1- 2]。根據(jù)不同的產(chǎn)卵季節(jié)與地理位置，北太平洋柔魚被劃分為冬春生西部群體、冬春生中東部群體、秋生中部群體與秋生東部群體[3]。其中，冬春生西部群體為我國(guó)大陸魷釣船的傳統(tǒng)捕撈對(duì)象，而秋生群體主要為原流刺網(wǎng)作業(yè)海域捕撈對(duì)象。柔魚資源量豐富，且在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要的地位，被認(rèn)為是最重要的大洋性柔魚類之一[4]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柔魚漁業(yè)生物學(xué)[5- 6]、資源評(píng)估[7- 8]等方面進(jìn)行深入的研究，有關(guān)其群體遺傳學(xué)的研究體現(xiàn)在不同的研究方法上。Katugin[9]運(yùn)用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢測(cè)出北太平洋柔魚東西部群體由于等位基因頻率不連續(xù)分布產(chǎn)生的遺傳差異。而劉連為等[10]基于線粒體DNA標(biāo)記研究了北太平洋柔魚種群遺傳結(jié)構(gòu)，認(rèn)為柔魚冬春生群體與秋生群體以及不同的地理群體之間不存在顯著的遺傳分化。作為漁業(yè)管理的基本單元，柔魚各群體間是否存在顯著的遺傳變異有待進(jìn)一步研究。

微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀重復(fù)序列，又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)。SSR標(biāo)記具有高度多態(tài)性、共顯性、實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使得它在群體遺傳學(xué)分析、基因克隆、育種改良以及連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[11]。目前，頭足類很多種類的微衛(wèi)星標(biāo)記已被分離、篩選，并應(yīng)用到群體遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中[12- 13]。而柔魚微衛(wèi)星DNA的分離在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，本研究采用磁珠富集法篩選柔魚微衛(wèi)星標(biāo)記，并應(yīng)用于群體遺傳多樣性檢測(cè)，以期為柔魚資源的可持續(xù)利用和科學(xué)管理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柔魚樣本按照地理位置劃分為西北群體和東北群體，存放于船艙冷庫(kù)中并運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室。取套膜肌肉組織，置于95%乙醇中，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。西北群體和東北群體分別由3個(gè)部分組成，命名為西北群體1(northwest population 1，NW1)、西北群體2(northwest population 2，NW2)、西北群體3(northwest population 3，NW3)與東北群體1(northeast population 1，NE1)、東北群體2(northeast population 2，NE2)、東北群體3(northeast population 3，NE3)。利用耳石微結(jié)構(gòu)獲得的日齡數(shù)據(jù)并結(jié)合捕撈日期推算孵化時(shí)間，劃分出冬春生群體(NW1、NW2、NE1)和秋生群體(NW3、NE2、NE3)(表1)。限制性內(nèi)切酶Sau3AI、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。Biospin Gel Extraction Kit購(gòu)自杭州博日科技有限公司，Dynabeads M- 280 Streptavidin為Invitrogen Dynal AS產(chǎn)品。探針(AG)12、(AC)12、接頭引物及微衛(wèi)星引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 柔魚樣本采集信息

1.2 基因組DNA的提取

采用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取DNA，洗脫緩沖液EB溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。

1.3 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建及微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建主要參考孫效文等[14]方法。限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，Biospin Gel Extraction Kit回收250—1000 bp大小片段。基因組DNA片段與Brown接頭連接:

A：5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT

B：5′-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC

最后將富集的微衛(wèi)星DNA片段經(jīng)pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，從而建立柔魚部分基因組文庫(kù)。挑選含有微衛(wèi)星片段的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)其核心序列兩端保守的側(cè)翼序列，用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增篩選具有較高特異性與多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。

1.4 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL、TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、DNA模板20 ng、ddH2O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離、Biospin Gel Extraction Kit純化后，送至上海邁浦生物科技有限公司，通過(guò)ABI3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀分析，以ROX- 500為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，通過(guò)Genemapper Version 3.5軟件讀取微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)分子量數(shù)據(jù)確定個(gè)體各位點(diǎn)基因型，利用POPGEN 3.2[15]進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，計(jì)算等位基因數(shù)(Na)，有效等位基因數(shù)(Ne)，觀測(cè)雜合度(Ho)，期望雜合度(He)與Shannon多樣性指數(shù)(Shannon′s information index，I)。多態(tài)信息含量(PIC)由CERVUS 3.0[16]軟件計(jì)算，并采用馬爾科夫鏈(Markov Chain)方法進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。利用ARLEQUIN 3.5[17]計(jì)算群體遺傳分化的F-統(tǒng)計(jì)量(F-statistics，F(xiàn)st)及分子方差分析(AMOVA)。利用POPGEN 3.2計(jì)算群體間的Nei′s遺傳距離，并基于該遺傳距離用MEGA 5.0[18]構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹。根據(jù)遺傳距離及地理距離數(shù)據(jù)在Excel中作線性相關(guān)圖，其中兩地理坐標(biāo)間直線距離計(jì)算方法參照韓忠民[19]的方法。利用STRUCTURE 2.3[20]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，分析最佳K值，即群體遺傳結(jié)構(gòu)的理論群體數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星序列特征

隨機(jī)挑取800個(gè)菌落，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后，共有68個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆率為8.5%。對(duì)所有的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，有60個(gè)(88.24%)克隆含有微衛(wèi)星序列(部分微衛(wèi)星序列已提交到Genbank，Genbank登錄號(hào)為：KC855227—KC855255)。重復(fù)次數(shù)在11—20次間的34個(gè)(44.74%)，重復(fù)20次以上的微衛(wèi)星32個(gè)(42.10%)，最高重復(fù)次數(shù)為33次。其中，完美型微衛(wèi)星46個(gè)(60.53%)，非完美型微衛(wèi)星28個(gè)(36.84%)，混合型微衛(wèi)星2個(gè)(2.63%)(表2)。除探針使用的AC/TG、AG/TC重復(fù)外，還得到ACAG、AGAC重復(fù)序列。

表2 柔魚微衛(wèi)星不同類型重復(fù)序列所占比例

2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性及群體的遺傳多樣性

選擇合成的20對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)柔魚30個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有12對(duì)能擴(kuò)增出特異條帶，其中8對(duì)具有多態(tài)性，并應(yīng)用于6個(gè)不同地理位置的柔魚群體遺傳學(xué)分析，引物的核心序列、產(chǎn)物大小及退火溫度等情況如表3所示。各位點(diǎn)在所有群體中的擴(kuò)增結(jié)果見表4，等位基因數(shù)(Na)為44—52個(gè)，有效等位基因數(shù)(Ne)介于4.11—30.15之間；觀測(cè)雜合度(Ho)介于0.640—0.840之間，期望雜合度(He)介于0.747—0.969之間；多態(tài)信息含量(PIC)介于0.787—0.987之間，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5)，Shannon多樣性指數(shù)(I)介于1.772—3.638之間。位點(diǎn)Bo103與位點(diǎn)Bo105極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

6個(gè)不同地理位置的柔魚群體遺傳多樣性如表5所示。NW1群體的平均等位基因數(shù)最多(Na=25.13)，NW3群體最少(Na=15.00)；NW2群體的平均有效等位基因數(shù)最多(Ne=9.91)，NW3群體最少(Ne=7.96)；NE2群體的平均觀測(cè)雜合度最高(Ho=0.761)，NW3群體最低(Ho=0.672)；NW1群體的平均期望雜合度最高(He=0.851)，NE1群體最低(He=0.808)；NW1群體的多態(tài)性息含量最高(PIC=0.918)，NE3群體最低(PIC=0.779)。NW1群體的Shannon多樣性指數(shù)最高(I=2.571)，NW3群體最少(I=2.215)?？傮w上，6個(gè)不同地理位置的柔魚群體均具有較高的遺傳多樣性。

表3 柔魚8對(duì)微衛(wèi)星引物特征

表4 柔魚8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性

表5 6個(gè)不同地理位置的柔魚群體遺傳多樣性

2.3 群體遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)分析

AMOVA分析顯示群體間遺傳差異主要來(lái)自于個(gè)體間，僅有0.56%的遺傳差異來(lái)自于群體間，遺傳變異不顯著(表6)。NW1群體與NE2群體間遺傳分化系數(shù)Fst為負(fù)值，說(shuō)明兩群體間無(wú)遺傳分化。其余群體間遺傳分化系數(shù)介于0.0016—0.0244之間，屬于輕微程度的分化(Fst<0.05)，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)不顯著，進(jìn)一步表明群體間不存在顯著的遺傳差異?；贜ei′s遺傳距離(表7)的UPGMA聚類樹顯示，NE1群體與NE3群體聚為一族群，其余4個(gè)群體聚為一族群，且NW1群體與NE2群體首先聚在一起(圖1)。群體間的遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析結(jié)果如圖2所示，二者沒有呈現(xiàn)出正相關(guān)性(R=0.175，P>0.05)。STRUCTURE 2.3軟件執(zhí)行2—6的假設(shè)K值，重復(fù)次數(shù)為10次，根據(jù)K值對(duì)應(yīng)參數(shù)的趨勢(shì)分析，推斷本研究所有參試個(gè)體最佳分組為1個(gè)理論群。

表6 柔魚群體分子方差分析

表7 柔魚群體間Nei′s遺傳距離(DA，對(duì)角線以下)及F統(tǒng)計(jì)值(Fst，對(duì)角線以上)

圖1 基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類樹

圖2 群體間Nei′s遺傳距離和地理距離的散點(diǎn)圖

3 討論與分析

本文以北太平洋傳統(tǒng)作業(yè)漁場(chǎng)柔魚為樣本對(duì)分離的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，篩選出8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(Ho=0.754)，所有樣本均擴(kuò)增出條帶。應(yīng)用這些微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)北太平洋6個(gè)不同地理位置的柔魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)獲得50.5個(gè)等位基因與17.08個(gè)有效等位基因，多態(tài)性信息含量均較高(PIC>0.5)，適用于柔魚群體遺傳學(xué)分析。位點(diǎn)Bo103與位點(diǎn)Bo105對(duì)NE1群體及NE3群體擴(kuò)增時(shí)，部分樣本未擴(kuò)增出條帶，個(gè)別樣本僅顯現(xiàn)小片段等位基因的條帶，造成該位點(diǎn)純合體個(gè)體過(guò)剩。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示這2個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，因此，2個(gè)位點(diǎn)很可能存在無(wú)效等位基因。無(wú)效等位基因產(chǎn)生的原因主要為微衛(wèi)星側(cè)翼序列變異，從而導(dǎo)致該位點(diǎn)無(wú)法正常擴(kuò)增[21]。而大片段等位基因丟失也會(huì)造成無(wú)效等位基因，這些在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中均體現(xiàn)出[22]。無(wú)效等位基因會(huì)對(duì)遺傳學(xué)相關(guān)研究結(jié)果造成顯著影響，在以后的實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)重新設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物或者估算無(wú)效等位基因頻率進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

6個(gè)不同地理位置的柔魚群體平均觀察雜合度介于0.672—0.761，平均期望雜合度介于0.808—0.851，與太平洋褶柔魚(Todarodespacificus)和阿根廷滑柔魚(Illexargentinus)的雜合度相近，分別為Ho：0.200—0.950，He：0.644—0.950；Ho：0.59—0.93，He：0.62—0.96[23- 24]。因此，各群體顯示出較高的雜合性。Katugin[9]利用18個(gè)蛋白酶位點(diǎn)檢測(cè)北太平洋柔魚東西部2個(gè)群體的遺傳變異水平，只有1個(gè)蛋白酶位點(diǎn)顯示出明顯的遺傳差異及較高的雜合度(Ho=0.294，He=0.322)。東西部群體平均觀察雜合度分別為：0.060 ± 0.021與0.043 ± 0.022，平均期望雜合度分別為0.056 ± 0.020與0.043 ± 0.022，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)的雜合度水平。蛋白質(zhì)標(biāo)記為基因表達(dá)的產(chǎn)物，所檢測(cè)到的遺傳差異水平很容易受到周圍環(huán)境的影響。劉連為等[10]利用線粒體標(biāo)記檢測(cè)出北太平洋柔魚2個(gè)產(chǎn)卵季節(jié)群體具有較低的核苷酸多樣性水平。由此可見，微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于物種群體遺傳變異水平研究較其它分子遺傳標(biāo)記有一定的優(yōu)越性。

本研究所取樣本為東西部2個(gè)不同產(chǎn)卵群體，其中NW1、NW2、NE1群體為冬春生群體，NW3、NE2、NE3群體為秋生群體。兩兩群體間的Fst值與AMOVA分析結(jié)果顯示，群體間的遺傳分化程度較低，未達(dá)到顯著性水平，遺傳差異主要存在于個(gè)體間。6個(gè)群體UPGMA聚類分析顯示，NE1群體和NE3群體親緣關(guān)系最近，聚為一類，而地理位置相距較遠(yuǎn)的NW1群體與NE2群體親緣關(guān)系最近，另聚為一類，而且它們屬于不同的產(chǎn)卵季節(jié)群體。群體間的遺傳距離與地理距離相關(guān)性結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了不同地理群體間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與地理距離不成正相關(guān)性。北太平洋海域缺乏顯著的地理障礙，而且柔魚個(gè)體具有較強(qiáng)的游泳能力，在海流的作用下，群體之間存在較強(qiáng)的基因交流[25]。Chen等[26]基于胴長(zhǎng)與耳石輪紋半徑的線性關(guān)系在東北太平洋和西北太平洋柔魚群體間的差異，推測(cè)兩部分大型雌性群體(胴長(zhǎng)>350 mm)可能來(lái)自于同一群體，這與利用STRUCTURE 2.3軟件推斷的北太平洋柔魚存在1個(gè)理論群相一致。

柔魚資源量豐富，已有研究認(rèn)為傳統(tǒng)作業(yè)漁場(chǎng)最大可持續(xù)產(chǎn)量為8×104—10×104t[7]，而原流刺網(wǎng)作業(yè)海域柔魚資源量則超過(guò)30×104t[8]。但作為短生命周期種類，柔魚種群資源量的大小很容易受到環(huán)境變化的影響而發(fā)生波動(dòng)[27]。2009年8—10月旺汛期間由于水溫變動(dòng)，傳統(tǒng)作業(yè)漁場(chǎng)柔魚產(chǎn)量出現(xiàn)大幅度下降，其日產(chǎn)量?jī)H為正常年份的一半[28]。2010—2012年本課題組對(duì)原流刺網(wǎng)作業(yè)海域柔魚資源量進(jìn)行探捕調(diào)查，取得了較高的產(chǎn)量。因此，在對(duì)北太平洋柔魚資源進(jìn)行評(píng)估與管理時(shí)，為了更加合理地開發(fā)、利用與保護(hù)該漁業(yè)資源，建議將不同的產(chǎn)卵季節(jié)—地理群體看作1個(gè)管理單元。

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