川佛手中總黃酮的超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化

鄧 祥，黃小梅，吳 狄

(1.四川文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州 635000;

2.四川文理學(xué)院“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點實驗室，四川 達(dá)州 635000)

川佛手中總黃酮的超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化

鄧 祥1，2，黃小梅1，2，吳 狄1，2

(1.四川文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州 635000;

2.四川文理學(xué)院“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點實驗室，四川 達(dá)州 635000)

采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取川佛手中的總黃酮，通過單因素分析和正交試驗，確定了川佛手中總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，即萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為50℃，料液比為100∶120 g/mL和萃取時間為2.0 h，在此條件下總黃酮的萃取率達(dá)到3.79﹪.

超臨界CO2萃取;川佛手;總黃酮

佛手又名佛手柑、五指橘，為蕓香科植物佛手(Citrusmedica L.var.sarcodactylis Swingle)的果實［1-2］.其味辛、苦、甘，性溫，無毒;入脾、肝、胃三經(jīng)，有理氣化痰、止嘔消脹、舒肝健脾、和胃止痛等多種功效.作為我國一種傳統(tǒng)的中藥材，佛手具有極高的藥用價值，并可與多種中藥材配伍使用，對咳嗽痰多、肝胃不和、肝郁氣滯等疾病具有很好的療效［3-4］.佛手在中國栽培歷史悠久，主要種植于廣東、四川、浙江和福建等地.此外，廣西、安徽、云南等省區(qū)也有栽培.因產(chǎn)地不同，主要分為廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手等品種［5-6］.其主要有效化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮、多酚和糖類等物質(zhì)［7］.黃酮類物質(zhì)是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的以黃酮(二苯基色原酮)為母核的一系列同類化合物［8］.研究表明，這類物質(zhì)具有多種生物特性和生理活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和保健品等領(lǐng)域［9-10］.當(dāng)前，有關(guān)總黃酮的提取方法主要有酶解輔助法、大孔樹脂吸附法、超濾法和微波提取法等［11-12］.這些方法一般能耗高、用時長和提取效率低等.超臨界CO2萃取技術(shù)作為一種新型萃取技術(shù)，具有速度快、易分離、無毒害殘留和對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)無損傷等優(yōu)點，特別適合易氧化和熱敏性物質(zhì)的萃取分離［13］.本文以川佛手為原料，通過超臨界CO2萃取技術(shù)得到川佛手有效化學(xué)成分，利用紫外分光光度法實現(xiàn)對黃酮類化合物的檢測，通過單因素分析和正交試驗，對總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，以期為川佛手的質(zhì)量控制和總黃酮的提取等提供理論和技術(shù)依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器設(shè)備

HA420-40-96型超臨界二氧化碳萃取儀(南通華安);DFY-5型冷凝水循環(huán)系統(tǒng)(鞏義予華);UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津);TG328A型電子天平(上海精密儀器有限公司);BZF-30真空干燥箱(上海博迅);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);60目篩子.

1.2 實驗試劑

佛手(四川達(dá)州產(chǎn));蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海試劑);無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和亞硝酸鈉等均為分析純;實驗用水均為二次蒸餾水.

2 方法與實驗

2.1 超臨界 CO2萃?。?4］

準(zhǔn)確稱取經(jīng)60目過篩的川佛手粉末100 g裝入料筒中，接著將料筒裝入萃取釜，裝好壓環(huán)和密封圈，旋緊堵頭，然后開啟超臨界CO2萃取儀，設(shè)定好儀器參數(shù)(壓力、溫度、CO2流量和萃取時間等)后，進(jìn)行萃取，收集萃取液，將萃取液定容至500 mL，依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑結(jié)合紫外-可見分光光度計進(jìn)行定性分析和定量測定.

2.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定［15-17］

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，用適量乙醇完全溶解，定容至 100 mL，作為儲備液.再從儲備液中分別吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL于1～7號25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5﹪(質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞硝酸鈉溶液，混合均勻后靜置5 min，加1.0 mL 10﹪(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鋁溶液，靜置5 min，再加入5.0 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，靜置15 min，定容.以第1瓶作為空白參比，在蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長510 nm處測定其吸光度，以濃度和吸光度分別為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品總黃酮測定［18］

將經(jīng)超臨界CO2流體萃取的萃取液按2.2的方法處理后，測定其吸光度，從而得到總黃酮濃度，再按下式計算其萃取效率.

其中:C為萃取液中的總黃酮濃度(g·mL-1)，V為萃取液的體積(mL)，M為川佛手的質(zhì)量(g).

2.4 單因素分析［19-20］

據(jù)文獻(xiàn)報道，萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、物料粒度、料液比、改性劑種類和濃度等因素對萃取率都會產(chǎn)生影響.本實驗根據(jù)萃取物的自身特點，主要研究萃取壓力、萃取溫度、料液比(物料量與夾帶劑之比)和萃取時間等因素對川佛手中總黃酮萃取率的影響.

2.5 正交試驗設(shè)計

根據(jù)2.4中單因素分析結(jié)果，以總黃酮萃取率為指標(biāo)，做四因素三水平即L9(34)正交試驗，按表1進(jìn)行正交試驗設(shè)計.

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素分析

3.1.1 萃取壓力對萃取率的影響

在萃取溫度為50℃、CO2流量為35 kg/h、萃取時間為2 h的條件下，分別討論在萃取壓力為10、20、30、40、50 MPa 的情況下對總黃酮萃取率的影響，實驗結(jié)果如圖2所示.

圖2 萃取壓力對萃取率的影響

從圖2可知，在一定壓力范圍內(nèi)，總黃酮的萃取率隨著壓力的增大而增加，但當(dāng)壓力為30 MPa后，萃取率基本趨于穩(wěn)定.這主要是因為壓力小于20 MPa時，流體以亞臨界狀態(tài)存在，不利于黃酮的萃取，萃取率較低;當(dāng)壓力大于20 MPa后，流體以臨界狀態(tài)存在，隨著壓力的增大，超臨界狀態(tài)的CO2的密度增加，總黃酮在CO2中的溶解能力隨之增強(qiáng)，有利于黃酮的萃取，萃取率增加;當(dāng)壓力過大超過30 MPa后，原料可能被壓實甚至結(jié)塊，不利于物質(zhì)的萃取，因此沒有得到更多的黃酮類物質(zhì).從綜合萃取率及能耗等方面因素考慮，選擇30 MPa作為后續(xù)實驗的萃取壓力，此時萃取率為2.86﹪.

3.1.2 萃取溫度對萃取率的影響

在萃取壓力為30 MPa、CO2流量為35 kg/h、萃取時間為2 h的條件下，分別討論在萃取溫度為 30、35、40、45、50 ℃的情況下對總黃酮萃取率的影響，實驗結(jié)果如圖3所示.

圖3 萃取溫度對萃取率的影響

從圖3可知，在起初階段，總黃酮的萃取率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)萃取溫度達(dá)到45℃時，萃取率達(dá)到最大值，之后隨著溫度的升高萃取率呈現(xiàn)下降趨勢.這主要是因為溫度低于30℃時，流體以亞臨界狀態(tài)存在，不利于萃取，萃取率低;隨著溫度的升高，加劇了分子的熱運(yùn)動，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，萃取率增大;同時隨著溫度的升高，CO2的密度降低，其溶解能力下降，致使萃取率呈現(xiàn)下降趨勢;黃酮類物質(zhì)屬熱敏性物質(zhì)，溫度過高，易分解，最終表現(xiàn)為萃取率降低.綜合能耗及以上因素，選擇萃取溫度45℃作為參考溫度，此時萃取率為3.12﹪.

3.1.3 料液比對萃取率的影響

在萃取壓力為30 MPa、萃取溫度為45℃、CO2流量為35 kg/h、萃取時間為2 h的條件下，分別討論在料液比為 100∶60、100∶80、100∶100、100∶120、100∶140 g/mL 的情況下對總黃酮萃取率的影響，如圖4所示.

圖4 料液比對萃取率的影響

從圖4中發(fā)現(xiàn)，在一定的料液比情況下，萃取率隨著夾帶劑的增加而增大，當(dāng)料液比達(dá)到100∶100 g/mL時，萃取率基本穩(wěn)定，沒有明顯的變化趨勢.可能是夾帶劑的用量增加，萃取出溶質(zhì)的濃度較低，有利于黃酮類化合物的溶出;但夾帶劑用量過大，萃取液的量增加，從而對后續(xù)操作不利.因此選擇料液比100∶100 g/mL作為參考料液比，此時萃取率為3.32﹪.

3.1.4 萃取時間對萃取率的影響

在萃取溫度為45℃、壓力為30 MPa、CO2流量為35 kg/h的條件下，分別討論在萃取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 的情況下對總黃酮萃取率的影響，如圖5所示.

圖5 萃取時間對萃取率的影響

從圖5可以看出，隨著萃取時間的延長，黃酮類化合物的萃取率不斷增大，但實驗表明，萃取時間達(dá)到1.5 h后，即使時間繼續(xù)延長，萃取率的增加值也變化微弱，因為此時黃酮類物質(zhì)基本萃取完全.所以從節(jié)能方面考慮，選擇1.5 h為參考萃取時間，此時萃取率為3.22﹪.

3.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗分析和正交水平表，對萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、料液比(C)和萃取時間(D)4因素進(jìn)行L9(34)正交試驗，試驗結(jié)果和極差分析見表2所示.

由表2可知，各因素對萃取率的影響程度大小順序為:B＞A＞D＞C，超臨界萃取的最佳提取工藝為:A2B3C3D3，即萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為50℃，料液比為100∶120 g/mL和萃取時間為2.0 h.此條件下總黃酮的最大萃取率為3.62﹪.

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果

3.3 驗證試驗結(jié)果分析

根據(jù)正交試驗優(yōu)化結(jié)果，在最佳提取工藝條件下做平行實驗，考察川佛手中黃酮萃取率的最優(yōu)水平條件，如表3所示.

表3結(jié)果顯示，在最佳萃取條件下采用3組平行試驗進(jìn)行驗證，可得川佛手中總黃酮的萃取率為 3.79﹪，RSD 為 0.10﹪.

表3 最佳萃取條件下的驗證試驗結(jié)果

4 結(jié)論

超臨界萃取法是中藥材有效化學(xué)成分提取的發(fā)展方向，具有萃取效率高、分離效果好、物質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性不受影響等優(yōu)點，適用于易氧化和熱敏性物質(zhì)的提取.本文采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，通過單因素分析和正交試驗，得到了川佛手中總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，即萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為50℃，料液比為100∶120 g/mL和萃取時間為2.0 h，總黃酮的萃取率達(dá)到3.79﹪.

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(責(zé)任編輯 穆 剛)

Process optim ization of total flavonoids from chuan bergamot by supercritical CO2extraction

DENG Xiang1，2，HUANG Xiaomei1，2，WU Di1，2

(1.Department of Chem istry and Chem ical Engineering，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou Sichuan 635000，China;
2.Key Laboratory of the Research on Characteristic Plants of Universities in Sichuan Province，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou Sichuan 635000，China)

The total flavonoids was extracted from Chuan Bergamot by supercritical CO2extraction.The optimal parameterswere determined as follows:extraction pressure was 30 MPa;extraction temperature was 50 ℃;solid-liquid ratio was 100∶120(g/mL)and extraction time was 2.0 h by single factor tests and orthogonal experiments.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids is 3.79﹪.

supercritical CO2extraction;Chuan Bergamot;total flavonoids

TQ028.8

A

1673-8004(2014)05-0094-05

2014-03-25

四川省教育廳重點資助項目(13ZA0101);達(dá)州市科技局重點資助項目(JCYJ1119).

鄧祥(1974-)，男，四川達(dá)縣人，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究.