Simul5軟件在毛細(xì)管電泳柱上富集模擬中的應(yīng)用*

張紅醫(yī) 王子川 劉偉 石志紅 單金緩

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 河北保定071002)

由于毛細(xì)管電泳分析方法具有樣品用量少、試劑用量少、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為分離科學(xué)家族中的一個(gè)重要工具［1］。目前已有多種用于毛細(xì)管電泳的檢測(cè)器，如激光誘導(dǎo)熒光、質(zhì)譜、電化學(xué)檢測(cè)器等，但大多數(shù)商品毛細(xì)管電泳儀標(biāo)配的檢測(cè)器仍為柱上UV檢測(cè)器。如果將毛細(xì)管內(nèi)徑近似作為光程長(zhǎng)度，則可從朗伯比爾定律推知，這種檢測(cè)方法的最低檢測(cè)濃度較高，對(duì)于低濃度的樣品難以給出令人滿意的檢測(cè)信號(hào)。為了解決這一問(wèn)題，很多柱上富集技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［2］。在數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的動(dòng)態(tài)模擬軟件不僅可以幫助人們快速地優(yōu)化分離富集條件，而且可以使人直觀地看到每一時(shí)刻富集的微觀變化過(guò)程;更重要的是在實(shí)施過(guò)程中，操作者完全不需要掌握復(fù)雜的數(shù)學(xué)計(jì)算。目前應(yīng)用較為廣泛的模擬軟件是Simul5［3］和Gentrans［4］，它們的應(yīng)用在國(guó)外重要期刊已有報(bào)道［5-7］，但在中文文獻(xiàn)中卻鮮有述及。

目前，一些高校已在大學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)設(shè)了有關(guān)毛細(xì)管電泳的實(shí)驗(yàn)［8-11］，為了進(jìn)一步推動(dòng)毛細(xì)管電泳在大學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用，本文介紹了Simul5軟件的使用方法，并通過(guò)實(shí)例模擬了瞬時(shí)等速毛細(xì)管電泳對(duì)模型離子的富集。

1 Simul5的安裝與使用

1.1 Simul5的下載與安裝

Simul5是由Ga?研究組［3］開(kāi)發(fā)的動(dòng)態(tài)毛細(xì)管電泳模擬軟件。該軟件可從http://www.natur.cuni.cz/gas免費(fèi)下載。下載的壓縮包中不僅包含Simul5的使用手冊(cè)和一些實(shí)例文件，更重要的是含有擴(kuò)展名為exe的文件。Simul5軟件不需要安裝，直接點(diǎn)擊exe文件即可在Windows平臺(tái)上運(yùn)行該軟件。該軟件由在邏輯上和功能上密不可分的3個(gè)視窗組成，這3個(gè)視窗的名稱(chēng)分別為Simul5(圖1)、Addconstituent(圖2)和Runsetup(圖3)。下面依次介紹這3個(gè)視窗。

1.2 Simul5的主視窗

Simul5視窗為軟件的主界面，可粗分為上下兩個(gè)區(qū)域。上半部分為設(shè)置顯示部分。在模擬過(guò)程中，不僅需要電泳分離實(shí)驗(yàn)的儀器參數(shù)(如電泳分離所使用的電壓、運(yùn)行過(guò)程中流經(jīng)毛細(xì)管柱的電流、電滲流大小等)，還需要電泳分離過(guò)程中的物質(zhì)參數(shù)(如背景電解質(zhì)溶液組成、pH以及分析物的pKa等基本信息)。除此之外，為了完成動(dòng)態(tài)模擬過(guò)程，還需要設(shè)定一些模擬參數(shù)。依據(jù)所承擔(dān)實(shí)驗(yàn)功能的不同，可將設(shè)置顯示區(qū)自左至右進(jìn)一步分為3個(gè)區(qū):儀器運(yùn)行參數(shù)顯示區(qū)、物質(zhì)組成區(qū)以及模擬控制區(qū)(圖1)。下半部分為動(dòng)態(tài)模擬狀態(tài)顯示區(qū)。

圖1 Simul5主界面

1.3 AddConstituent視窗

分析物及背景電解質(zhì)成分的淌度u和離解常數(shù)pKa等是模擬優(yōu)化所必需的基本物理化學(xué)常數(shù)，這些數(shù)據(jù)需要用戶根據(jù)實(shí)際情況從軟件自備數(shù)據(jù)庫(kù)中選用。選擇后，在Simul5主界面區(qū)右上部的“物質(zhì)組成區(qū)”處將顯示具體數(shù)值信息。

圖2 物質(zhì)添加窗口

點(diǎn)擊位于Simul5視窗右上部的“組分區(qū)”中的“Add”按鈕，就可打開(kāi)AddConstituent視窗(圖2)。如果要使用20mmol/L的醋酸作為電泳分析的背景電解質(zhì)溶液，可以在位于此窗口下面的“Databaseof constituents”欄中找到“ACETICACID”(醋酸的英文名稱(chēng))。在其同行右側(cè)部分，可以依次看到與該物質(zhì)對(duì)應(yīng)的負(fù)電荷數(shù)n，正電荷數(shù)p，離解常數(shù)pKa和極限淌度值u。雙擊此行，該物質(zhì)的英文名稱(chēng)ACETIC ACID將顯示在“Name”下的空白處，而其對(duì)應(yīng)的電荷、pKa和u等信息將顯示在窗口右上側(cè)的空白區(qū)。然后，在“Concentration”下空白處鍵入20(注:在軟件界面顯示的單位為“mM”，而按法定計(jì)量單位應(yīng)顯示為“mmol/L”)，在“Type”選項(xiàng)中選擇 BGE(BackgroundElectrolyte背景電解質(zhì)的縮寫(xiě))，在“C(Injection)”中鍵入20，最后點(diǎn)擊位于右下角的“Accept”按鈕，完成物質(zhì)信息的添加過(guò)程。

由于軟件自備數(shù)據(jù)庫(kù)的容量有限，如果作為分析物或者背景電解質(zhì)成分的化合物還沒(méi)有被收集到此數(shù)據(jù)庫(kù)中，就需要從手冊(cè)或文獻(xiàn)中查到其相關(guān)信息并補(bǔ)充進(jìn)數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中任何一個(gè)合法的物質(zhì)必須具備完備的信息(名稱(chēng)、正電荷數(shù)p、負(fù)電荷數(shù)n、酸度常數(shù)pKa和有效淌度u等信息缺一不可)。要進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充，需選擇在Simul5主界面視窗左上部的功能欄Tools中的“AmphlinesWizard”選項(xiàng)，點(diǎn)擊此選項(xiàng)會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框，先輸入要?jiǎng)?chuàng)建的物質(zhì)數(shù)目，再點(diǎn)擊OK鍵，然后在再次彈出的對(duì)話框中輸入創(chuàng)建物質(zhì)的名稱(chēng)，點(diǎn)擊OK，然后再次分別輸入該物質(zhì)的最小負(fù)電荷和最大正電荷以及相應(yīng)的解離常數(shù)(pKa)和淌度值(u)，最后輸入該物質(zhì)的濃度，單擊Yes，完成添加。至此，該化合物的基本信息就已添加到數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.4 RunSetup視窗

單擊位于Simul5主界面上方偏左的“RunSetup”按鈕，可開(kāi)啟RunSetup(圖3)視窗。該視窗分為6個(gè)模塊，分別為“InitialConditionsandDetectorPosition”、“EnvironmentandCapillarySetup”、“Walls(BordersofCalculatedSpace)”、“InitiatePositionofWalls”、“WallRefreshRate(Steps)”、“PSQSave”和“PowerMode”。

圖3 運(yùn)行設(shè)置窗口

“InitialConditionsandDetectorPosition”模塊承擔(dān)著設(shè)定初始條件和檢測(cè)器位置的任務(wù)，包含著幾個(gè)重要的模擬參數(shù)?！癐njectionSite(mm)”負(fù)責(zé)樣品注射位置的設(shè)定，其值為毛細(xì)管柱中樣品初始帶寬的一半?！癉etectorPosition(mm)”負(fù)責(zé)檢測(cè)器位置的設(shè)定。當(dāng)圖1“模擬控制區(qū)”中的“Enabledetector”的選項(xiàng)被勾選，在主界面的“運(yùn)行狀態(tài)區(qū)”的淺色豎線就代表著檢測(cè)器的位置。如果勾選了位于Simul5主界面的“行狀態(tài)區(qū)”的“EOFbydetector”，程序?qū)凑找言谥鹘缑妗癊OFMobility(1E-9)”設(shè)定的電滲流大小來(lái)連續(xù)移動(dòng)檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)對(duì)電滲流的模擬。為了節(jié)省模擬節(jié)點(diǎn)數(shù)，檢測(cè)器可以放到模擬范圍外，因而只有當(dāng)檢測(cè)器到達(dá)模擬區(qū)域后才能進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。點(diǎn)擊Simul5主視窗上的“Sim/Det”可以觀察到檢測(cè)信號(hào)?！癈apillaryLength”用于設(shè)定毛細(xì)管的模擬長(zhǎng)度。將毛細(xì)管的模擬長(zhǎng)度與“AdditionalLength(Run Setup)”(附加長(zhǎng)度)結(jié)合在一起才能計(jì)算出運(yùn)行過(guò)程中的實(shí)際電流大小。當(dāng)使用“AddConstituent”視窗中“AdvancedSetup”時(shí)，也會(huì)用到毛細(xì)管模擬長(zhǎng)度?！癙eakWidth”負(fù)責(zé)注射帶寬度的設(shè)定?！癙eak EdgeWidth”是各種注射帶初始平滑銜接的量度，決定著初始的濃度分布、淌度和pKa輪廓?！癕esh Density(Nodes)”表示模擬空間的獨(dú)立分組(注意:使用的節(jié)點(diǎn)數(shù)要比MeshDensity值大1)。這個(gè)值越大，陡峭邊界的數(shù)字?jǐn)[動(dòng)就越小，但模擬時(shí)間隨之變長(zhǎng)。通過(guò)降低電壓或者電流(Simul5主窗口)也可以平滑邊界。

“EnvironmentandCapillarySetup”模塊主要包括更新速率和dt優(yōu)化參數(shù)的設(shè)定?！癟emperature”的設(shè)定用于由淌度值計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)?！癈apillaryDiameter”的設(shè)定用于由電流密度來(lái)計(jì)算流經(jīng)毛細(xì)管的電流大小。“EditsRefreshRate”是主窗口中可編輯值(時(shí)間，誤差等)的更新頻率?！癎raphRefreshRate”是圖形更新頻率?！癉etectorInput”是檢測(cè)器數(shù)據(jù)采集頻率。如果數(shù)據(jù)采集量過(guò)大，其他操作(如打開(kāi)、保存等)可能會(huì)變慢。實(shí)際項(xiàng)目中的數(shù)據(jù)采集量可以通過(guò)位于主菜單Tools中“Tools/Detector”里的“DetectorDataTool”進(jìn)行減半處理?！癘ptimizationInterval”是dt優(yōu)化頻率(需預(yù)先在主窗口中選用“Optimisedt”)。由于dt變化時(shí)，誤差值的穩(wěn)定需要一定的時(shí)間，所以這個(gè)值不能過(guò)高?！癲tOptimizationIncrement”的默認(rèn)值為0.25。

對(duì)于普通用戶來(lái)講，一般只需對(duì)“InitialConditionsandDetectorPosition”模塊和“Environmentand CapillarySetup”模塊中的內(nèi)容進(jìn)行選擇，包括注射位置、檢測(cè)器位置、毛細(xì)管的模擬長(zhǎng)度、峰寬、實(shí)驗(yàn)溫度、毛細(xì)管內(nèi)徑及電源模式(恒電壓或者恒電流)等，除此之外的其他參數(shù)均可用默認(rèn)值。

1.5 模擬與結(jié)果輸出

在完成上述3個(gè)視窗中參數(shù)的設(shè)定后，依次點(diǎn)擊位于Simul5主界面上的初始化按鈕“Init”與模擬運(yùn)行按鈕“Run”，模擬運(yùn)行即開(kāi)始。

當(dāng)模擬實(shí)驗(yàn)物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器后，單擊運(yùn)行控制欄的“Stop”按鈕可結(jié)束模擬。然后單擊主界面中的“Save”按鈕，在彈出的對(duì)話框中選擇保存的路徑并輸入保存文件的名稱(chēng)，文件將以sna格式保存。

模擬數(shù)據(jù)的導(dǎo)出是先點(diǎn)擊菜單欄中“Tools”下拉菜單里的“ExportAlltoCsv”選項(xiàng)，在彈出的“Export All”對(duì)話框中輸入導(dǎo)出文件夾的名稱(chēng)，再點(diǎn)擊“OK”即可。導(dǎo)出的文件夾會(huì)默認(rèn)保存在名為ExportProfiles的文件夾中，導(dǎo)出的Excel文件分為兩大類(lèi):一類(lèi)是以det開(kāi)頭的，表示的是模擬峰形通過(guò)檢測(cè)器的數(shù)據(jù);另一類(lèi)是以sim開(kāi)頭的，表示的是模擬峰形在毛細(xì)管中的數(shù)據(jù)?？梢栽诮鈮何募写蜷_(kāi)Export Profiles文檔，從中找到此前保存的文件，文件中所有數(shù)據(jù)以csv格式保存，可以利用Excel程序?qū)⑵浯蜷_(kāi)，并利用其他作圖軟件作圖。

1.6 模擬參數(shù)設(shè)置的要點(diǎn)

模擬參數(shù)的設(shè)定不僅會(huì)影響模擬時(shí)間的長(zhǎng)短，而且也與模擬結(jié)果的正確性相關(guān)。不正確的參數(shù)設(shè)定可造成模擬圖形產(chǎn)生較大的波動(dòng)，甚至在模擬過(guò)程中彈出錯(cuò)誤窗口。

在模擬實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)盡量選擇較小的電壓或電流，也可以增加“GridPoints”的數(shù)值(數(shù)值范圍為500～50000);合理設(shè)置“SetMaxError”的數(shù)值對(duì)動(dòng)態(tài)模擬圖的影響也很重要，如果想提高模擬速度，可以將此值調(diào)得大一些。當(dāng)不了解模擬的具體情況時(shí)，可以選擇Optimizedt選項(xiàng)，系統(tǒng)會(huì)以最優(yōu)時(shí)間進(jìn)行模擬。若需要提高模擬速度，可以增大dt或增大SetMaxError的數(shù)值。

在模擬實(shí)驗(yàn)與實(shí)際實(shí)驗(yàn)相對(duì)比時(shí)，有如下的設(shè)置規(guī)則，定義L0=10L1且V0=100V1(L0為實(shí)驗(yàn)的柱長(zhǎng);L1為模擬實(shí)驗(yàn)的柱長(zhǎng)。單位均為mm。V0為實(shí)驗(yàn)的電壓，單位為kV;V1為模擬電壓，單位為V)。運(yùn)用此規(guī)則進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)時(shí)，模擬峰形與實(shí)驗(yàn)峰形相比會(huì)略有些展寬。如果所有模擬參數(shù)值的設(shè)置與實(shí)驗(yàn)設(shè)定值相一致，可避免峰展寬的效應(yīng)，但是會(huì)加大計(jì)算機(jī)的工作量，顯著增加模擬時(shí)間。

2 Simul5模擬區(qū)帶電泳與瞬時(shí)等速電泳過(guò)程

毛細(xì)管電泳具有多種操作模式，主要有區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)色譜、等電聚焦等，其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳是最常用的分離模式。一般檢測(cè)手段為柱上紫外檢測(cè)，由于短光程會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度不高，為解決這一問(wèn)題，可將柱上瞬時(shí)等速電泳與區(qū)帶電泳相結(jié)合。為此，以Simul5模擬了瞬時(shí)等速電泳，并觀察了不同階段的富集變化。

2.1 模擬條件與參數(shù)設(shè)置

富集模型離子的物理參數(shù)為pKa-1.37與淌度值30×10-5cm2·V-1·s-1。作為分離電解質(zhì)組分的三羥甲基氨基甲烷(Tris)的有效淌度值與pKa分別為29.5×10-5cm2·V-1·s-1和8.076;作為前導(dǎo)離子及背景電解質(zhì)組分的氯離子的有效淌度值與pKa分別為79.1×10-5cm2·V-1·s-1和-2.7;氫氧化鈉的有效淌度值與pKa分別為51.9×10-5cm2·V-1·s-1和13.7;作為尾隨電解質(zhì)的MES(嗎啉乙磺酸)的有效淌度值與pKa分別為28×10-5cm2·V-1·s-1和6.095。

為了節(jié)省模擬時(shí)間，設(shè)定模擬毛細(xì)管柱長(zhǎng)為8mm。檢測(cè)器的位置為8mm，進(jìn)樣端位置為2mm，峰寬為2mm，峰的邊緣寬度為0.1mm，格點(diǎn)數(shù)為2000，模擬溫度為25℃，毛細(xì)管內(nèi)徑為75μm，恒壓-200V，其余的參數(shù)設(shè)置維持默認(rèn)值。

2.2 模擬分析

圖4為區(qū)帶電泳的模擬圖。分析對(duì)象為一陰離子，其 pKa為 -1.37，淌度值為30×10-5cm2·V-1·s-1。從圖4可以明顯看出，由于進(jìn)樣體積較大，由初始狀態(tài)0s運(yùn)行至1.7s，沒(méi)有富集效果，樣品區(qū)帶存在明顯的展寬現(xiàn)象。當(dāng)樣品初始濃度保持0.1mmol·L-1和進(jìn)樣時(shí)間不變的前提下，以氯離子為前導(dǎo)離子，以MES為尾隨電解質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)模型離子的柱上富集(圖5)。由圖5可見(jiàn)，在0～3s的富集過(guò)程中，模型離子的帶寬明顯減少，模型離子的高度逐漸增加(從0.1mmol·L-1增加到8.2 mmol·L-1)，可達(dá)到82倍的富集效果。

圖4 Simul5模擬毛細(xì)管區(qū)帶電泳

圖5 Simul5模擬毛細(xì)管瞬時(shí)等速電泳

3 結(jié)論

毛細(xì)管電泳是一種值得在本科實(shí)驗(yàn)中推廣使用的分析方法。Simul5為動(dòng)態(tài)模擬毛細(xì)管電泳的富集與分離提供了很好的手段。它不僅可以避免實(shí)驗(yàn)的盲目性，而且可以幫助學(xué)生加深對(duì)毛細(xì)管電泳分離與富集過(guò)程的微觀理解，是不可多得的可用于毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)的免費(fèi)輔助軟件。

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