大腸桿菌堿性磷酸酶在E.coli BL21（DE3）中的胞內(nèi)可溶性表達(dá)

包劍銘，郭小帆，趙雪飛，李雨麗，粱藝旋，唐金寶Δ

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500）

大腸桿菌堿性磷酸酶在E.coli BL21（DE3）中的胞內(nèi)可溶性表達(dá)

包劍銘1，郭小帆2，趙雪飛1，李雨麗1，粱藝旋1，唐金寶1Δ

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500）

目的構(gòu)建原核表達(dá)載體 pEAP，在 E.coil BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)大腸桿菌堿性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的胞內(nèi)可溶性表達(dá)，為進(jìn)一步研究工程菌的大體積培養(yǎng)條件、提高其表達(dá)量提供理論基礎(chǔ)。方法以質(zhì)粒pDAP2為模板擴(kuò)增不含信號(hào)肽的EAP基因，克隆至pGreen-S質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體pEAP，以E.coli BL21（ED3）菌株表達(dá)EAP，采用SDS-PAGE及EAP酶活性測定對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性及胞內(nèi)定位進(jìn)行分析；Ni2＋親和層析方式純化目的蛋白并測定其比活力。結(jié)果經(jīng)PCR、雙酶切及測序分析證實(shí)載體構(gòu)建正確，所表達(dá)目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21（ED3）菌體細(xì)胞質(zhì)，其相對(duì)分子量與理論值相符（47kD）且具有EAP催化活性；目的蛋白經(jīng)His Trap親和層析純化后，其電泳純度在90%以上，酶比活力可達(dá)358.6 U／mg。結(jié)論成功構(gòu)建pEAP質(zhì)粒表達(dá)載體，目的蛋白在BL21（ED3）菌株胞內(nèi)主要以可溶性形式表達(dá)，為進(jìn)一步更經(jīng)濟(jì)、高效制備EAP奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

大腸桿菌；堿性磷酸酶；細(xì)胞質(zhì)；可溶性表達(dá)

1 材料與方法

1.1 材料 pGreen-S質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；pDAP 2質(zhì)粒［6］由本實(shí)驗(yàn)室保存（含 E.coli JM81 alkaline phosphatase gene，GeneBank accession number：U35316）；E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）購自碧云天生物技術(shù)研究所。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Sac I、Pst I購自Takara公司；λDNA marker（EcoR I＋Hind III）、DL5000 DNA Marker分別購自生工生物工程（上海）公司及Takara公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽（pNPP）為 Sigma產(chǎn)品；His Trap親和層析柱購自 GE Healthcare。本實(shí)驗(yàn)所用引物及測序由大連Takara公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 EAP基因（去除信號(hào)肽）擴(kuò)增及載體構(gòu)建：根據(jù)E.coli AP基因序列及pGreen-S載體序列分析，使用oligo 6設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增除去5′信號(hào)肽序列的 EAP基因，F(xiàn)1：5′-GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3′（Sac I內(nèi)切酶位點(diǎn)）及 R1： 5′-GCTACTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTGCGATATC-3′（Pst I內(nèi)切酶位點(diǎn)及6×His-tag純化標(biāo)簽）。利用上述引物，以質(zhì)粒pDAP2為模板，50μL PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增不帶信號(hào)肽的EAP基因。反應(yīng)結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后用Sac I、Pst I雙酶切，與同樣雙酶切的表達(dá)載體pGreen-S以T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB／Amp篩選平板37℃過夜培養(yǎng)后，菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。PCR陽性菌落轉(zhuǎn)至LB／Amp液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒Sac I、Pst I雙酶切驗(yàn)證，對(duì)成功插入片段的克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.2 EAP表達(dá)、可溶性分析及胞內(nèi)定位：將鑒定正確的重組質(zhì)粒pEAP轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞并涂布LB／Amp平板，構(gòu)建基因工程表達(dá)菌株。從上述LB／Amp平板隨機(jī)挑取單菌落接于20mL新鮮的LB／Amp液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，8 000 r／min離心收集菌體。

在基因工程菌體沉淀中加入適量蒸餾水重懸菌體，冰浴中超聲破碎細(xì)胞，10 000 r／min離心10min，收集上清和沉淀，12%SDS-PAGE分析目的蛋白的存在形式。另取等量基因工程及E.coli BL21（DE3）菌（對(duì)照），滲透壓休克法（osmotic shock extraction）釋放菌體周質(zhì)腔蛋白［7］，測定滲透壓釋放物的 EAP活性。

1.2.3 EAP的純化：以含50mM咪唑的0.1 M TBS（含Tris 100mM，NaCl 0.5M，pH 7.2）溶液重懸菌體，冰浴超聲破壁后，12 000 r／min離心去除菌體碎片，0.22μm濾膜過濾上清后，0.5mL／min流通His Trap親和層析柱，以含50mM咪唑的0.1M TBS溶液沖洗層析柱至A280值不再變化，以含250 mM咪唑的0.1M TBS溶液洗脫并收集洗脫組分，Millipore超濾離心管（分子截留量10kD）8 000 r／min離心，脫鹽濃縮至合適體積。

1.2.4 EAP活性測定：純化的EAP以BCA蛋白定量試劑盒定量測定后，酶測定體系參考《生物化學(xué)與分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)》［8］并稍作改進(jìn)。10μL EAP溶液加190μL pNPP工作液（50 mM的Tris-HCl中含2mM乙酸鎂，10mM pNPP，pH 10.0）30℃反應(yīng)10 min，加入1.8 mL的1 M NaOH終止反應(yīng)，測定反應(yīng)液A405吸光值?；盍挝唬║）定義為以pNPP為底物，反應(yīng)溫度30℃，每分鐘產(chǎn)生1 nmol pNP（對(duì)硝基酚）所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果

2.1 EAP基因的擴(kuò)增及載體構(gòu)建 以質(zhì)粒pDAP2為模板，以F1／R1為引物擴(kuò)增不帶AP信號(hào)肽的EAP基因片段，預(yù)計(jì)擴(kuò)增DNA長度為1369 bp。瓊脂糖電泳中1，2泳道所示在1 375 bp左右有明顯條帶（圖1a）。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收純化，Sac I、Pst I雙酶切與經(jīng)同樣雙酶切的pGreen-S載體連接轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，陽性菌落PCR鑒定結(jié)果顯示1 375 bp左右亦有擴(kuò)增目的條帶（圖1b），對(duì)Sac I、Pst I雙酶切驗(yàn)證PCR鑒定的陽性克隆后（圖1c）進(jìn)行基因測序，結(jié)果表明所擴(kuò)增的 EAP與Genebank所公布的基因序列一致。

圖1 EAP基因克隆、陽性克隆菌落PCR及酶切鑒定M1.λDNA marker（EcoR I＋Hind III）；M2.DL5000 DNA Marker；1.目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物；3.陰性對(duì)照；4.陽性克隆質(zhì)粒Sac I、Pst I雙酶切鑒定Fig.1 EAP gene cloning and positive clones analyzingM1.λDNA marker（EcoR I＋Hind III）；M2.DL5000 DNA Marker；1.products of PCR for target gene；2.products of PCR positive clone；3.negative control；4.analyse of positive cloning plasmid by Sac I＋PstI

2.2 EAP基因的表達(dá)、胞內(nèi)定位及可溶性分析 含質(zhì)粒pEAP的E.coli BL21（DE3）菌株 37℃振蕩培養(yǎng) 12 h后，取200μL菌液離心，對(duì)菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。EAP的Mr理論值為47.5 kD，SDS-PAGE結(jié)果顯示約47 kD處有一明顯蛋白條帶，與理論值相符（圖2，lane 2）。通過超聲破壁菌體分析目的蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果顯示超聲上清部分含有大量目的蛋白（圖2，lane 3）。

圖2 大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析M.蛋白質(zhì) marker；1.E.coli BL21（DE3）對(duì)照菌；2.pEAP／E.coli BL21（DE3）菌；3.pEAP／E.coli BL21（DE3）菌超聲上清；4.純化的 EAPFig.2 SDS－PAGE analysis of the expression product of E.coliM.proteinmarker；1.Control E.coli BL21（DE3）；2.pEAP／E.coli BL21（DE3）；3.ultrasonic supernatant of pEAP／E.coli BL21（DE3）；4.purified EAP

對(duì)菌體的超聲破壁上清及滲透壓休克釋放周質(zhì)腔蛋白的堿性磷酸酶活性分析如圖3，結(jié)果顯示pEAP／E.coli BL21（DE3）滲透壓休克上清與對(duì)照菌E.coli BL21（DE3）無明顯差別，應(yīng)為菌株自身固有的堿性磷酸酶；而pEAP／E.coli BL21（DE3）超聲破壁上清中A405較高，說明pEAP／E.coli BL21（DE3）主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

圖3 EAP在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)定位分析1.pEAP／E.coli BL21（DE3）超聲上清；2.pEAP／E.coli BL21（DE3）滲透壓休克上清；3.E.coli BL21（DE3）超聲上清；2.E.coli BL21（DE3）滲透壓休克上清Fig.3 Localization analysis of recombinant EAP in E.coli1.ultrasonic supernatant of pEAP／E.coli BL21（DE3）；2.osmotic shock supernatant of pEAP／E.coli BL21（DE3）；3.ultrasonic supernatant of E.coli BL21（DE3）；4.osmotic shock supernatant of E.coli BL21（DE3）

2.3 EAP基因的純化及活性 pEAP／E.coli BL21（DE3）菌體超聲上清流通上樣His Trap親和層析柱，以含不同濃度咪唑0.1M TBS溶液洗脫目的蛋白，在咪唑濃度250mM時(shí)，目的蛋白即可被洗脫，純化后其電泳純度達(dá)90%以上（圖2，lane 4）；洗脫液經(jīng)超濾離心脫鹽、BCA法蛋白含量測定，可從100 mL培養(yǎng)液的pEAP／E.coli BL21（DE3）菌體中純化得到6.2 mg目的蛋白，純化后的EAP比活可達(dá)358.6 U／mg。

3 討論

天然EAP由phoA基因編碼，在氨基末端帶有一個(gè)信號(hào)肽的前體合成，前體由結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)面的多聚核糖體合成，在向胞周間隙分泌過程中，信號(hào)肽被位于內(nèi)膜外側(cè)的信號(hào)肽酶切除［2，4］。重組 EAP基因利用自身信號(hào)肽可實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)［9］，盡管分泌表達(dá)具有降低目的蛋白的酶解等優(yōu)點(diǎn)［10］，但有限的周質(zhì)空間使得產(chǎn)物表達(dá)量往往不高。pGreen-S質(zhì)粒［11］是本實(shí)驗(yàn)室在pUC 18基礎(chǔ)上改造的、以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的缺失和LacZ的藍(lán)白斑為雙篩選標(biāo)記的質(zhì)粒載體，EGFP及ZZ親和肽利用該載體在E.coliDH5α的胞內(nèi)均獲得可溶性表達(dá)［11-14］，且表達(dá)量與是否有IPTG誘導(dǎo)無關(guān)。本研究將不含信號(hào)肽的EAP基因重組至pGreen-S構(gòu)建的原核表達(dá)載體 pEAP，在 E.coil BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)了EAP的胞內(nèi)可溶性表達(dá)，為胞內(nèi)表達(dá)方式制備可溶性EAP奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室曾嘗試?yán)肊.coli DH5α作表達(dá)菌株，但未見目的蛋白表達(dá)；Angkawidjaja等［15］將不帶信號(hào)肽的AP基因克隆至pUC18構(gòu)建pUC18-AP載體并利用E.coli DH5α表達(dá)，也未獲成功，這可能與EAP的蛋白結(jié)構(gòu)及菌株的基因型有關(guān)。盡管本研究實(shí)現(xiàn)了EAP基因在大腸桿菌胞內(nèi)可溶性表達(dá)，并利用金屬親和方式簡便高效地純化了目的蛋白；但當(dāng)pEAP／E.coli BL21（DE3）工程菌擴(kuò)大體積培養(yǎng)后，目的蛋白表達(dá)量大幅度降低，因此進(jìn)一步研究工程菌的大體積培養(yǎng)條件，提高表達(dá)量將是下一步工作的重點(diǎn)。

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（編校：吳茜）

Soluble expression of Escherichia coli alkaline phosphatase in prokaryotic cytop lasm of Escherichia coli BL21（DE3）

BAO Jian-ming1，GUO Xiao-fan2，ZHAO Xue-fei1，LIYu-li1，LIANG Yi-xuan1，TANG Jin-bao1Δ

（1.Colleage of Pharmacy and Biology，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；2.Weifang Nursing Vocational College，Qingzhou 262500，China）

ObjectiveTo construct prokaryotic vector pEAP for expression of Escherichia coli alkaline phosphatase in Escherichia coli BL21（DE3）intracellular as soluble protein，provide a theoretical basis to improve the expression level in large volume in the further study of engineering bacteria culture conditions.MethodsEAP gene，without signal peptide，was amplified with polymerase chain reaction（PCR）from plasmid pDAP2，and then inserted into the plasmid pGreen-S to obtain pEAP，and the recombinant plasmid pEAPwas transferred into E.coli BL21（ED3）.The target protein was analyzed by SDS-PAGE and EAP enzyme activity assay.And His Trap affinity chromatography was applied to separation and purify the target proteins.ResultsThe results of PCR，double enzyme digestion and sequencing analysis showed that the pEAP vector was constructed correctly，and SDS-PAGE showed that the target protein with a relative molecular weightwas consistent with the theoretical values（47 kD）and catalytic activity of EAP，which mainly exists as a soluble form of E.coli BL21（ED3）in cytoplasm of E.coli.The target protein was purified by His Trap affinity chromatography.specific activity was up to 358.6 U／mg protein and electrophoresis purity was more than 90%.ConclusionpEAP plasmid vector is constructed successfully.Itwas high efficiency and soluble intracellular expression target protein in the E.coli BL21（ED3）.Thus this research provides an experimental data for the further preparation of the EAP in economic and efficientways.

Escherichia coli；alkaline phosphatase；prokaryotic cytoplasm；soluble expression

Q591.2

A

1005－1678（2014）05－0164－03

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）是一包含2個(gè) Zn2＋和1個(gè)Mg2＋的金屬酶［1］，純化后的AP被廣泛用于生命和醫(yī)學(xué)科學(xué)等領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)標(biāo)記、分子生物學(xué)及酶標(biāo)記免疫分析等。AP廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其中大腸桿菌堿性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatsae，EAP）作為 AP模型得到最為充分的研究，該酶是同源二聚體蛋白［2］，其單體前體的N端有一段22個(gè)氨基酸殘基的疏水信號(hào)肽序列，可引導(dǎo)EAP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞周質(zhì)間隙［3-5］，有限的周質(zhì)空間使得產(chǎn)物的表達(dá)量很低，致使EAP制備效率低、成本高。本研究旨在通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pEAP，在 E.coil BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)大腸桿菌堿性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的胞內(nèi)可溶性表達(dá)，為進(jìn)一步研究工程菌的大體積培養(yǎng)條件、提高其表達(dá)量提供理論基礎(chǔ)。

國家自然科學(xué)基金（81201346）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2013HL066）

包劍銘，男，本科，研究方向：藥學(xué)，E-mail：swyw＠wfmc.edu.cn；唐金寶，通信作者，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物免疫藥物，E-mail：tangjb＠wfmc.edu.cn。