轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)載紫杉醇納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向性研究

鐘玲，李思齊，楊蔚，曾蓉，毛琴，陳嘉舅

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省第一人民醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650101）

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)載紫杉醇納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向性研究

鐘玲1，2，李思齊3，楊蔚2，曾蓉2，毛琴2，陳嘉舅3

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省第一人民醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650101）

目的制備轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異結(jié)合肽T7修飾載紫杉醇納米粒（T7-NPs-PTX），研究其對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的靶向抑制作用。方法采用薄層法利備納米粒共聚焦顯微鏡觀察結(jié)腸癌RKO細(xì)胞和血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞對T7-NPs-PTX的攝取情況。MTT實驗研究T7-NPs-PTX對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的毒性；流式細(xì)胞儀檢測T7-NPs-PTX對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。構(gòu)建RKO細(xì)胞腫瘤球模型，研究T7-NPs-PTX對腫瘤球的生長抑制能力。構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠異位模型，研究T7-NPs-PTX對裸鼠腫瘤生長抑制作用。結(jié)果RKO細(xì)胞對經(jīng)過T7修飾后的T7-NPs-PTX攝取顯著增加，但HUVEC細(xì)胞對T7-NPs-PTX的攝取無顯著變化。T7-NPs-PTX對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖抑制作用和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用顯著強(qiáng)于NPs-PTX和PTX溶液。結(jié)論經(jīng)過T7修飾后能夠增強(qiáng)納米粒與結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的親和力，T7-NPs-PTX是一種潛在、高效的結(jié)腸癌靶向給藥系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；紫杉醇；藥物靶向；納米粒

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Leica 7CSSP5雙掃描激光共聚焦顯微鏡（Leica公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；紫杉醇（連云港恒瑞藥業(yè)）；香豆素-6（coumarin-6，美國 sigma公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）。聚己內(nèi)酯-聚乙二醇2000（PCL-PEG2000，山東省醫(yī)療器械研究所）；人源結(jié)腸癌細(xì)胞（RKO，上海細(xì)胞研究所），人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，美國ATCC）。雄性裸鼠（成都達(dá)碩實驗動物公司，合格證號：SCDW2013-1154）。

1.2 方法

1.2.1 T7-NPs-PTX的制備：參照文獻(xiàn)［5-6］方法合成 PCLPEG2000-T7。取 PCL-PEG2000-T7 12.88 mg、PCL-PEG2000 4.48mg和紫杉醇1.65mg，共同溶于丙酮，緩慢滴加入不斷攪拌中的水中，攪拌2 h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液中的有機(jī)溶劑，得到T7共修飾的紫杉醇納米粒。用適量香豆素-6取代紫杉醇制備得到香豆素-6標(biāo)記的納米粒。

1.2.2 細(xì)胞攝取實驗：將對數(shù)生長期的 RKO細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞以5×105個／孔的密度接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量載香豆素-6的不同納米粒溶液，使孔中香豆素-6的濃度為20 ng／mL，37℃分別孵育4 h后將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2μg／mL DAPI溶液，室溫孵育15min，加冰 PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取。

1.2.3 細(xì)胞毒性實驗：體外培養(yǎng)RKO細(xì)胞，接種于96孔板中，1×107個／孔。當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入經(jīng)無菌過濾的T7-NPs-PTX、NPs-PTX和PTX溶液各20μL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的量使孔中紫杉醇濃度分別為0.3、3、10、30μg／mL。將孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后取出，每孔加入5mg／mLMTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入DMSO 200μL，37℃避光振搖15min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值（OD），每組設(shè)3個復(fù)孔，計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實驗：按“1.2.3”項下培養(yǎng)細(xì)胞并給藥，將RKO細(xì)胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ITC／PI雙染，細(xì)胞避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.2.5 腫瘤球生長抑制實驗：取對數(shù)生長期的RKO細(xì)胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來后離心，棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于用低熔點瓊脂糖預(yù)處理的96孔板中，將96孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。7 d后成長為腫瘤球。第8 d加入T7-NPs-PTX、NPs-PTX和PTX溶液。以PBS為陰性對照組，統(tǒng)計腫瘤球體積變化。

1.2.6 腫瘤生長抑制實驗：RKO細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個／mL。取4～6周齡，體質(zhì)量20～30 g的雄性裸鼠，將準(zhǔn)備好的RKO細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1mL細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的40只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，PBS組、PTX溶液組、NPs-PTX組和T7-NPs-PTX組。各組均采用尾靜脈注射給藥，第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RKO細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞對T7-NPs的攝取 體外細(xì)胞攝取實驗表明，RKO細(xì)胞對T7修飾納米粒的攝取量明顯大于未經(jīng)T7修飾納米粒，T7-NPs組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于NPs。HUVEC細(xì)胞對T7修飾納米粒的攝取效率與未經(jīng)T7修飾納米粒相當(dāng)，2者熒光強(qiáng)度相近（見圖1）。

圖1 激光共聚焦觀察RKO細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞對香豆素-6標(biāo)記納米粒的攝取Fig.1 Uptake of coumarin-6 loaded nanoparticles by RKO cells and HUVEC cells based on confocal laser scanningmicroscopy

2.2 T7-NPs-PTX對RKO細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果表明：T7-NPs-PTX、NPs-PTX和PTX溶液對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率隨著濃度增大而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。T7-NPs-PTX對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力強(qiáng)于NPs-PTX和PTX溶液，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖2）。

圖2 紫杉醇脂質(zhì)體對RKO細(xì)胞的增殖抑制率**P＜0.01，與PTX溶液和NPs-PTX組相比Fig.2 RKO cell viability at various concentration of PTX**P＜0.01，compared with PTX solution group and NPs-PTX group

2.3 T7-NPs-PTX對RKO細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡的定量實驗結(jié)果表明，T7-NPs-PTX、NPs-PTX和PTX溶液都能不同程度誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。T7-NPs-PTX誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著強(qiáng)于NPs-PTX和PTX，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖3）。

圖3 不同藥物干預(yù)對RKO細(xì)胞凋亡率的影響**P＜0.01，與PTX溶液和NPs-PTX組相比；ΔΔP＜0.01，與PBS組相比Fig.3 RKO cell apoptosis induced by PTX loaded nanoparticles**P＜0.01，compared with PTX solution group and NPs-PTX group；ΔΔP＜0.01，compared with PBS group

2.4 T7-NPs-PTX對RKO細(xì)胞腫瘤球生長的影響 腫瘤球生長抑制試驗結(jié)果顯示：RKO細(xì)胞腫瘤球給藥7 d后，PTX溶液、NPs-PTX和T7-NPs-PTX的腫瘤體積分別減小到原體積的77.2%、59.3%和44.1%，但陰性對照組腫瘤球的體積增大了1.22倍，T7-NPs-PTX組與PTX溶液和NPs-PTX組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。

表1 不同給藥對RKO細(xì)胞腫瘤球生長的抑制作用Tab.1 Inhibition of RKO cell tumor spheroid by different drugs

2.5 T7-NPs-PTX對荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響 荷瘤裸鼠治療實驗結(jié)果顯示，以PBS組為對照，經(jīng)過20天后，PTX溶液、NPs-PTX和T7-NPs-PTX對腫瘤生長具有明顯的抑制作用，T7-NPs-PTX與NPs-PTX組和PTX溶液組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；這說明，經(jīng)過T7修飾后能夠增強(qiáng)納米粒的腫瘤生長抑制能力（見表2）。

表2 不同藥物干預(yù)對結(jié)腸癌移植瘤的抑制率Tab.2 Inhibition rate of tumor by different drugs

3 討論

轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）可以與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤細(xì)胞表面大量特異表達(dá)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體成為腫瘤靶向研究的熱點［7-9］。T7（HAIYPRH）是一種由7個氨基酸組成的短序列肽，通過噬菌體展示技術(shù)從表達(dá)TFR的細(xì)胞中篩選得到，它也可以與TFR特異性結(jié)合，相比較于TF，T7修飾的納米粒更有優(yōu)勢，TF為大分子蛋白，其存在免疫原性，不利于遞藥系統(tǒng)的多次給藥［10-12］，且蛋白構(gòu)象的改變?nèi)菀讓?dǎo)致其功能的喪失［13］，而作為多肽的T7則不存在此問題；TF修飾的納米粒還會受到內(nèi)源性TF的抑制，而T7修飾的納米粒則不受到內(nèi)源性TF的抑制［14］等。本研究將T7肽通過共價鍵連接到納米粒的表面，利用結(jié)腸癌細(xì)胞表面大量表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)納米粒進(jìn)入細(xì)胞，實現(xiàn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向給藥。

本研究首先通過定性的共聚焦實驗證實，T7修飾的納米粒與結(jié)腸癌RKO細(xì)胞具有特異親和力，而對正常的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無親和力。這說明T7修飾納米粒能夠靶向結(jié)腸癌細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)入胞，而不會影響正常細(xì)胞。其次，本研究通過細(xì)胞增殖抑制實驗證實了T7-NPs-PTX對于結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制活性，呈紫杉醇濃度依賴性，且經(jīng)過T7修飾紫杉醇納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于游離紫杉醇溶液組和普通紫杉醇納米粒組，這說明紫杉醇納米粒發(fā)揮抗腫瘤作用依賴于腫瘤細(xì)胞對納米粒的攝取。經(jīng)過T7肽修飾后的納米粒攝取量增強(qiáng)，毒性增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實驗也得到了與細(xì)胞毒性實驗相同的結(jié)果。在某些實體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此給藥系統(tǒng)很難進(jìn)入腫瘤組織深部［15］。本研究構(gòu)建了體外腫瘤球模型用于模擬評價T7-NPs-PTX對實體腫瘤的生長抑制作用，結(jié)果顯示，經(jīng)過T7修飾后增強(qiáng)了紫杉醇納米粒對腫瘤球生長抑制作用。本研究還構(gòu)建了結(jié)腸癌異位腫瘤模型，結(jié)果與體外實驗結(jié)果相一致。綜上所述，經(jīng)過T7肽修飾后能夠增強(qiáng)紫杉醇納米粒進(jìn)入結(jié)腸癌細(xì)胞，是一種潛在的結(jié)腸癌給藥系統(tǒng)。

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（編校：吳茜）

Research of transferrin receptor mediated nanoparticles loaded paclitaxel targeting to colon cancer cell

ZHONG Ling1，2，LISi-qi3，YANGWei2，ZENG Rong2，MAO Qin2，CHEN Jia-yong3

（1.Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2.Department of Emergency，F(xiàn)irst People’s Hospital of Yunnan Province，Kunming 650032 China；3.Department of Emergency，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China）

ObjectiveTo prepare T7 peptide conjugated nanoparticles loaded aclitaxel（T7-NPs-PTX），evaluate its properties and study its effect on colon cancer.MethodsNanoparticles were prepared by nanopreparation method.The cellular uptake of RKO cell and HUVEC cell in vitro were observed by confocal laser.The anti-proliferation efficiency of T7-NPs-PTX was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids testwas used to evaluate antitumor ability of T7-NPs-PTX.RKO cell were xenografted into athymicmice to establish the animalmodel，which were used to evaluate the effectof anticancer.ResultsThe result demonstrated that T7-NPs uptaken by RKO cell was higher than that of LP.The MTT assay and the inhibition of tumor spheroids test in vitro confirmed strong inhibitory effect of T7-NPs-PTX.ConclusionT7-NPs-PTX is easy to prepare and it is a potential delivery system for the treatment of colon cancer.

transferrin receptor；paclitaxel；drug targeting；nanoparticles

R735.3

A

1005－1678（2014）05－0023－04

結(jié)腸癌是胃腸道常見腫瘤，發(fā)病率在我國呈逐年增高趨勢［1］?；熓悄壳敖Y(jié)腸癌的重要治療手段之一，患者的愈后在很大程度上取決于其對化療的反應(yīng)率。由于一般化療藥物有較大的不良反應(yīng)，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時對正常細(xì)胞也有很大的影響，導(dǎo)致患者對化療的順應(yīng)性低下。因此，尋找一種新的治療途徑來提高病人的化療順應(yīng)性并殺滅腫瘤細(xì)胞，靶向治療便顯得尤為重要［2-3］。T7肽是從轉(zhuǎn)鐵蛋白中得到的一條有效多肽，研究表明，T7肽對于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表面的親和力與轉(zhuǎn)鐵蛋白相近［4］，這說明轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的特異性結(jié)合主要是由T7所介導(dǎo)。本研究旨在通過將T7肽連接到納米粒表面，以紫杉醇為模型藥物，研究其對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向作用。

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目（2011FA029）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項基金項目（2010CD165）

鐘玲，女，博士，研究方向：胃腸道腫瘤，E-mail：zhongl87189812＠163.com；陳嘉勇，通信作者，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：胃腸道腫瘤，E-mail：xiaosha.dogy＠163.com。