重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療非小細(xì)胞肺癌的分子生物學(xué)研究

劉長(zhǎng)江，徐曉榮，馮國(guó)營(yíng)

（1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，山東 萊蕪 271100；2.濱州醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)研究所，山東 濱州 256603）

重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療非小細(xì)胞肺癌的分子生物學(xué)研究

劉長(zhǎng)江1，徐曉榮1，馮國(guó)營(yíng)2

（1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，山東 萊蕪 271100；2.濱州醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)研究所，山東 濱州 256603）

目的探討分子生學(xué)標(biāo)記物與重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）療效之間的關(guān)系。方法選擇符合要求的非小細(xì)胞肺癌患者68例，隨機(jī)均分為A組和B組，每組34例。A組采用多西他賽＋順鉑（docetaxel and cisplatin，DP）及吉非替尼化療，B組在A組化療方案的基礎(chǔ)上加用重組人血管內(nèi)皮抑制素。采用免疫組化的方法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermao growth factor receptor，EGFR）、KRAS基因（K-ras，p21）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、乳腺癌1號(hào)基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4與間變性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like-4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)1（excision repair cross complementing 1，ERCC1）、β-微管蛋白和分化抗原簇3（Cluster of differentiation 3，CD3）生物學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)情況。結(jié)合2組患者生物學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)情況和無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS），統(tǒng)計(jì)出適合不同方案的人群類型。結(jié)果B組的中位PFS較A組顯著延長(zhǎng)；無論VEGF和BRCA1低表達(dá)或高表達(dá)，B組的中位PFS較A組顯著提高；ERCC1、KRAS、EML4-ALK和β-微管蛋白高表達(dá)，B組的中位PFS較A組有顯著提高；EGFR和CD3低表達(dá)，B組的中位PFS較A組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)論VEGF和BRCA1高表達(dá)或低表達(dá)，KRAS、ERCC1、EML4-ALK和β-微管蛋白高表達(dá)及EGFR和CD3低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療較為敏感。

非小細(xì)胞肺癌；重組人血管內(nèi)皮抑制素；分子生物學(xué)

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年1月～2013年12月山東省萊蕪市人民醫(yī)院收治的肺癌根治術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者68例，年齡45歲～70歲，平均（55.3±0.9）歲，術(shù)后隨機(jī)分為2組，A組34例，男22例，女12例，給予多西他賽＋順鉑（docetaxel and cisplatin，DP）及吉非替尼化療；B組34例，男24例，女 10例，B組在A組化療方案的基礎(chǔ)上加用重組人血管內(nèi)皮抑制素，并將每例患者切除的組織制作成符合切片標(biāo)準(zhǔn)的病理蠟塊。2組患者年齡、性別、腫瘤級(jí)別分布、功能狀態(tài)（performance status，PS）評(píng)分和高血壓、糖尿病等慢性病史差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。排除術(shù)前接受過DP化療，有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病和神經(jīng)精神異常的患者。本實(shí)驗(yàn)得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 68例患者術(shù)后輔助化療方案均采用常規(guī)DP化療4個(gè)周期：第1 d靜脈滴注多西他賽（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20090104）75mg／m2，第1天至第3天靜脈滴注順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040813）25mg／m2，每個(gè)周期持續(xù) 21 d，每天給予吉非替尼（AstraZeneca UK Limited，國(guó)藥準(zhǔn)字 J20100014）250mg口服；B組患者在A組的基礎(chǔ)上每個(gè)周期的前14 d，每天靜脈滴注重組人血管內(nèi)皮抑制素（山東先聲麥得津生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20050088）15mg，期間常規(guī)給予水化、利尿、止吐、鎮(zhèn)痛、營(yíng)養(yǎng)等支持治療，如果并發(fā)大量胸水，采用間斷抽吸減壓，如果出現(xiàn)無法耐受的毒副反應(yīng)則停藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將符合研究條件的病理蠟塊切片，采用免疫組化法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermao growth factor receptor，EGFR）［8］、KRAS基因（K-ras，p21）［9］、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）［10］、乳腺癌 1號(hào)基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）［11］、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4與間變性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）［12］、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)1（excision repair cross complementing 1，ERCC1）［13］、β-微管蛋白［14］、分化抗原簇 315］（Cluster of differentiation 3，CD3）的表達(dá)情況。每批染色以磷酸鹽緩沖液代替一抗設(shè)定陰性空白對(duì)照，同時(shí)用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，“－～＋”認(rèn)定為低表達(dá)，“＋＋～＋＋＋”認(rèn)定為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件分析，患者的中位無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）采用 Kaplan-Meier法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者不同生物標(biāo)志物表達(dá)分布情況 通過采用免疫組化分析2組患者癌癥組織中不同生物標(biāo)志物（見表1、圖1）

表1 2組患者不同生物標(biāo)志物高表達(dá)和低表達(dá)分布Tab.1 Different biomarkers distribution with high expression and low expression in two groups

2.2 2組患者中位無進(jìn)展生存期比較 通過Kaplan-Meier法分析，結(jié)果顯示B組的中位PFS較A組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05，見圖 2）。

圖2 2組患者總的中位無進(jìn)展生存期比較Fig.2 Compare the overallmedian progression free survival in two groups

2.3 生物標(biāo)志物高表達(dá)與2組患者中位無進(jìn)展生存期的相關(guān)性 KRAS、VEGF、BRCA1、EML4-ALK、ERCC1和 β-微管蛋白高表達(dá)時(shí)，B組中位PFS較A組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。EGFR高表達(dá)時(shí)，2組中位PFS未見明顯差異（見圖3～圖9）。

圖3 KRAS高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位無進(jìn)展生存期比較Fig.3 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while KRASwith high expression

圖4 VEGF高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.4 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile VEGFwith high expression

圖5 BRCA1高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.5 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while BRCA1 with high expression

圖6 EML4-ALK高表達(dá)時(shí)兩組患者總的中位生存期比較Fig.6 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile EML4-ALK with high expression

圖7 ERCC1高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.7 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile ERCC1 with high expression

圖8 β微管蛋白高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.8 Compare the overallmedian progression free survival in two groups whileβ-tubulin with high expression

圖9 EGFR高表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.9 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EGFR with high expression

2.4 低表達(dá)水平的生物標(biāo)志物與2組患者中位生存期的相關(guān)性 EGFR、CD3、VEGF、KRAS和 BRCA1低表達(dá)時(shí)，B組中位PFS較A組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。EML4-ALK、ERCC1和β-微管蛋白低表達(dá)時(shí)，2組中位PFS未見明顯差異（見圖10～圖14）。

圖10 EGFR低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.10 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EGFR with low expression

圖11 CD3低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.11 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while CD3 with low expression

圖12 VEGF低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.12 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while VEGF with low expression

圖13 KRAS低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.13 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile KRASwith low expression

圖14 BRCA1低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.14 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile BRCA1 with low expression

圖15 EML4-ALK低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.15 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EML4-ALK with low expression

圖16 ERCC1低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.16 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while ERCC1 with low expression

圖17 β-微管蛋白低表達(dá)時(shí)2組患者總的中位生存期比較Fig.17 Compare the overallmedian progression free survival in two groups whileβ-tubulin with low expression

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，DP及吉非替尼聯(lián)用重組人血管內(nèi)皮抑制素用于NSCLC的術(shù)后輔助治療效果優(yōu)于DP及吉非替尼，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位無進(jìn)展生存期較DP及吉非替尼組明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。無論 VEGF、KRSA和BRCA1高表達(dá)或低表達(dá)，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位PFS較DP及吉非替尼組均顯著提高（P＜0.05）。ERCC1、β-微管蛋白和EML4-ALK高表達(dá)，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位PFS較DP及吉非替尼組有顯著提高（P＜0.05）；CD3和EGFR低表達(dá)，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位PFS較DP及吉非替尼組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。EGFR高表達(dá)，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位PFS較DP及吉非替尼組無顯著差異；EML4-ALK、ERCC1和β-微管蛋白低表達(dá)，DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組的中位PFS較DP及吉非替尼組無顯著差異。此結(jié)果提示，抗癌藥物的聯(lián)合應(yīng)用在非小細(xì)胞肺癌化療后的治療具有明顯優(yōu)勢(shì)，但是在研究中也有部分患者不能耐受2種藥物的聯(lián)合應(yīng)用。此外聯(lián)合應(yīng)用藥物組對(duì)于血管新生因子方面的抑制作用也優(yōu)于單一藥物治療。本研究結(jié)果提示，無論VEGF和 BRCA1高表達(dá)或低表達(dá)；KRAS、ERCC1、EML4-ALK和β-微管蛋白高表達(dá)及EGFR和CD3低表達(dá)的NSCLC患者可能對(duì)DP及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療方案較為敏感。

由于肺癌其死亡率高，在我國(guó)其發(fā)生率和死亡率達(dá)到80%以上，是目前國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)。該病大多為非小細(xì)胞肺癌［8-11］。由于外科手術(shù)切除病灶是治療NSCLC最有效的方法，但其術(shù)后生存率和晚期患者的生存質(zhì)量并不樂觀，因此腫瘤治療耐藥機(jī)制以及治療效果預(yù)測(cè)一直是腫瘤學(xué)專家最為關(guān)注的問題［12］。腫瘤分子靶向治療不僅可以阻滯腫瘤細(xì)胞的增殖、消滅腫瘤細(xì)胞，而且可以降低化療藥物的毒副作用。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑——吉非替尼目前治療NSCLC效果較為明顯［13-15］，但癥狀改善1年左右多數(shù)患者容易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，而針對(duì)耐受現(xiàn)象的后續(xù)治療目前沒有統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)［16］。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療可能會(huì)解決單一用藥的耐藥或抗藥性，減少組織細(xì)胞間的異質(zhì)性，對(duì)治療的反應(yīng)和敏感度有一定的改善效果［17］。重組人血管內(nèi)皮抑制素［18］主要從血管的形成和退縮方面抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本研究通過化療敏感性相關(guān)基因、腫瘤血管形成相關(guān)基因和細(xì)胞免疫相關(guān)基因的研究，檢測(cè)EGFR、VEGF等不同生物學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)合不同治療方案的結(jié)局，避免了單個(gè)分子生物學(xué)標(biāo)志物預(yù)測(cè)術(shù)后化療聯(lián)合輔助分子靶向治療評(píng)估療效的局限性，為綜合治療方法提供理論基礎(chǔ)，奠定生物學(xué)基礎(chǔ)，并可在接受術(shù)后輔助治療前，做好個(gè)體化評(píng)估和區(qū)分，為患者選擇更準(zhǔn)確、更合理的個(gè)性化治療方案，也在一定程度上避免了過度治療。

本研究病例數(shù)較少，在今后的研究中，需要更多的學(xué)者和多中心共同合作，擴(kuò)大樣本量，對(duì)更多的分子生物學(xué)指標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)研究，探索與NSCLC術(shù)后患者PFS的關(guān)系，努力尋求靶向治療藥物的特異性分子生物學(xué)指標(biāo)，建立有效的、個(gè)性化的治療療效預(yù)測(cè)模型，為患者提供個(gè)體化的綜合治療，從而改善患者的術(shù)后生活質(zhì)量，提高術(shù)后生存期。

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（編校：李璐璐）

M olecular biology research of recombinant human endostatin targeted therapy of non-small-cell lung cancer

LIU Chang-jiang1，XU Xiao-rong1，F(xiàn)ENG Guo-ying2

（1.Department of Respiratory Medicine，Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271100，China；2.Institute of Nearobiology，Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between molecular biologicalmarkers and recombinant human endostatin targeted therapy in non-small-cell lung cancer（NSCLC）.Methods68 cases patients with non-small-cell lung cancer to meet the requirements were random ly divided into group A（n＝34）and group B（n＝34）.Group A received docetaxel and cisplatin（DP）and gefitinib；group B received recombinant human endostatin on the base of group A.The biologicalmarkers species，such as，EGFR，KRAS，VEGF，BRCA1，EML4-ALK，ERCC1，β-tubulin and CD3 were detected by immunohistochemical.The types of population for differentprogramswere summarized according to the expression of biologicalmarkers and progression free survival（PFS）of the two groups.ResultsGroup B median PFSwas significantly longer than that in group A；no matter low or high expression of VEGF and BRCA1，group Bmedian PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）；high expression of ERCC1，KRAS，EML4-ALK and β-tubulin，group B median PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）；low expression of EGFR and CD3，group Bmedian PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）.ConclusionNo matter low or high expression of VEGF and BRCA1，low expression of KRAS，ERCC1，EML4-ALK andβ-tubulin and high expression of EGFR and CD3 in patients with non-small cell lung cancermay be more sensitive to the treatment of DP and gefitinib combined with recombinant human endostatin.

non-small cell lung cancer；recombinant human endostatin；molecular biology

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0100－06

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的一種類型，和其他類型肺癌一樣，治療以手術(shù)切除病變組織為主，但即使完全切除，Ⅰ期患者的術(shù)后5年生存率也只有50%左右，Ⅱ期和Ⅲ期患者存活率甚至不到30%［1-3］。針對(duì)這一情況，手術(shù)患者必須結(jié)合術(shù)后輔助化療。手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療的方法雖然取得一定成效，但同時(shí)一部分化療藥物出現(xiàn)不良反應(yīng)，且存在較高的復(fù)發(fā)率和死亡率。腫瘤分子靶向治療是隨分子生物學(xué)的發(fā)展越來越受關(guān)注和推崇的一種新型個(gè)體化輔助治療，是目前腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)，不同的基因表達(dá)對(duì)治療方案的敏感性不同，不同的靶向制劑具有不同的作用機(jī)制，適合不同類型的患者［4］。其中，吉非替尼［5］和重組人血管內(nèi)皮抑制素［6］是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的分子靶向藥物中的2種。然而越來越多的報(bào)道指出，隨著吉非替尼在臨床上的普遍應(yīng)用，耐藥率逐年增加，給臨床治療NSCLC帶來困難［7］。因此，本研究為探索適合術(shù)后輔助化療及吉非替尼聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素靶向治療的最佳適應(yīng)癥人群，旨在提高這類患者的生存率，并降低其復(fù)發(fā)率。

山東省高?？萍加?jì)劃（J11LF61）

劉長(zhǎng)江，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸內(nèi)科學(xué)，E-mail：liuchangjiangsd＠163.com。