三氧化二砷聯(lián)合紫杉醇對A549細(xì)胞增殖和裸鼠異位腫瘤生長的影響

吳曉鵬，劉孝民，劉勤，郭艷珍

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，河南 洛陽 471039）

三氧化二砷聯(lián)合紫杉醇對A549細(xì)胞增殖和裸鼠異位腫瘤生長的影響

吳曉鵬，劉孝民，劉勤，郭艷珍

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，河南 洛陽 471039）

目的探討三氧化二砷（As2O3）聯(lián)合紫杉醇（paclitaxel，PTX）對肺癌的治療作用。方法噻唑藍(lán)法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測As2O3聯(lián)合PTX抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。采用激光共聚焦顯微鏡觀察給藥后對肺癌A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。通過構(gòu)建體外腫瘤球模型觀察給藥后對腫瘤球的生長抑制，模擬給藥后藥物在體內(nèi)對腫瘤生長的抑制能力。建立肺癌裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為生理鹽水組、As2O3干預(yù)組、PTX干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組。每天分別用設(shè)定濃度的生理鹽水、As2O3、PTX、As2O3＋PTX對移植瘤小鼠腹腔內(nèi)注射給藥。觀察給藥后腫瘤大小的變化，計算抑瘤率。對腫瘤切片分別采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）進(jìn)行染色，考察As2O3、PTX、As2O3＋PTX誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。結(jié)果肺癌A549細(xì)胞給藥48 h后，生理鹽水組、As2O3干預(yù)組、PTX干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為（3.35±0.21）%、（47.55±2.25）%、（64.64±3.35）%和（84.58±3.76）%，各藥物干預(yù)組與生理鹽水組相比，差異的具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。生理鹽水組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞早期凋亡率為0.26%，As2O3干預(yù)組為9.7%，PTX干預(yù)組為17.8%，聯(lián)合干預(yù)組為42.5%，而與生理鹽水組、As2O3干預(yù)組和PTX干預(yù)組相比，聯(lián)合干預(yù)組能夠增加腫瘤細(xì)胞早期凋亡率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。腫瘤球給藥7d后生理鹽水組腫瘤球體積增大1.36倍，As2O3干預(yù)組、PTX干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組分別使腫瘤體積減小到原體積的（77.35±2.31）%、（61.68±2.44）%和（44.85±3.34）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。荷瘤裸鼠治療實驗以生理鹽水組為對照，As2O3干預(yù)組、PTX干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤生長的抑制率分別為（22.4±4.5）%、（39.5±6.2）%和（69.5±7.3）%，聯(lián)合干預(yù)組與其他組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論As2O3能夠有效增強PTX抑制A549細(xì)胞的增殖和裸鼠異位腫瘤的生長，As2O3聯(lián)合PTX可能作為肺癌潛在有效的治療手段。

As2O3；紫杉醇；肺腫瘤；聯(lián)合藥物療法；動物模型

肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤之首［1］。近年來，我國肺癌的發(fā)病率呈急劇上升趨勢。手術(shù)、放射治療和化療是當(dāng)前肺癌治療的主要手段，目前，早中期肺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。然而，以細(xì)胞毒藥物為主的化學(xué)治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)和毒性，患者耐受性較差。紫杉醇是來源于紅豆杉屬太平紫杉的一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，被廣泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤和非小細(xì)胞肺癌的治療［2-3］。三氧化二砷（As2O3）具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡及細(xì)胞毒等作用，用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了突出的療效［4］。本研究將紫杉醇與As2O3聯(lián)合使用，用于肺癌的治療研究，考察2者聯(lián)合使用對肺癌的治療效果，為As2O3應(yīng)用于肺癌臨床治療提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 胎牛血清購自美國life tech公司；注射用As2O3購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)；dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）試劑盒購自 sigma公司；hematoxylin-eosin（HE）試劑盒購自sigma公司；其余試劑為分析純。A549肺癌細(xì)胞購自上海細(xì)胞研究所；雄性裸鼠購自成都達(dá)碩實驗動物公司，動物許可證號：DS2012092。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將A549細(xì)胞置于含有100mg／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg／L胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 紫杉醇（paclitaxel，PTX）聯(lián)合As2O3對A549細(xì)胞的增殖抑制考察：培養(yǎng)A549細(xì)胞并接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時分別加入無菌過濾后的生理鹽水、As2O3（1mmol／mL）、PTX（10μg／mL）、As2O3＋PTX（As2O3為1mmol／mL，PTX為5μg／mL）。將孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20μL濃度為5mg／mLMTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37℃避光振搖15min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值（optical density，OD）。

1.2.3 PTX聯(lián)合As2O3誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡：為了定性觀察不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況，按照“1.2.2”項下給藥后于流式細(xì)胞儀檢測不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的能力。采用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核染色。37℃避光30 min，PBS清洗3次，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 腫瘤球的構(gòu)建：取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來后離心，棄去上清液用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于用低熔點瓊脂糖預(yù)處理的96孔板中，將96孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)。腫瘤球生長7 d后，加入無菌過濾后的As2O3（1 mmol／mL）、PTX（10μg／mL）、As2O3＋PTX（As2O3為 1mmol／mL，PTX為5μg／mL）。以生理鹽水為陰性對照組，統(tǒng)計腫瘤球體積大小變化。

1.2.5 肺癌異位瘤模型的構(gòu)建及紫杉醇聯(lián)合As2O3對腫瘤的生長抑制考察：A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個／mL。取4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g的雄性裸鼠，于本院實驗動物中心清潔級實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，晝夜照明24 h，相對濕度70%，飼養(yǎng)溫度25℃。將準(zhǔn)備好的A549細(xì)胞懸濁液皮下接種于小鼠背部，每只小鼠接種0.1mL細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的24只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，生理鹽水組、As2O3干預(yù)組（3mg／kg）、PTX干預(yù)組（10mg／kg）和 As2O3＋PTX聯(lián)合干預(yù)組（As2O33mg／kg＋PTX 5mg／kg）。各組均采用腹腔注射給藥。第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱重，計算抑瘤率。取腫瘤組織切片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法；正態(tài)計量資料用“±s”表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3增強PTX對A549細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT實驗結(jié)果如表1所示，As2O3和PTX均能抑制A549腫瘤細(xì)胞的增殖。As2O3和PTX對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率隨著時間延長而增加，呈現(xiàn)時間依賴性，聯(lián)合給藥組在48 h對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率與24 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)As2O3與PTX聯(lián)合干預(yù)時，降低PTX的給藥量，對A549細(xì)胞的增殖依然能夠產(chǎn)生強烈的抑制作用。且聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細(xì)胞的抑制能力強于 As2O3干預(yù)組和PTX干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。肺癌A549細(xì)胞給藥24 h和48 h后，各給藥組與生理鹽水組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 不同藥物干預(yù)對A549細(xì)胞的抑制率Fig.1 The inhibition rate of A549 cells by various drugs after 24 h and 48 h treatments

2.2 As2O3增強紫杉醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 體外研究藥物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的定量實驗結(jié)果表明，As2O3干預(yù)組、紫杉醇干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組都能不同程度誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。As2O3干預(yù)組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞早期凋亡率為9.7%，紫杉醇干預(yù)組為17.8%，聯(lián)合干預(yù)組為42.5%，而生理鹽水組早期凋亡率為0.26%。結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，紫杉醇干預(yù)組、As2O3干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與紫杉醇干預(yù)組和As2O3干預(yù)組相比，聯(lián)合干預(yù)組能夠增加腫瘤細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖2）。A549腫瘤細(xì)胞凋亡的共聚焦顯微定性實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后，生理鹽水組、紫杉醇干預(yù)組和As2O3干預(yù)組的細(xì)胞核形態(tài)均一，呈致密的圓形，無核質(zhì)核仁釋放的跡象，而聯(lián)合干預(yù)組的細(xì)胞核明顯發(fā)生變化，染色質(zhì)濃縮、核膜破裂、甚至出現(xiàn)凋亡小體（見圖3）。

圖2 不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率ΔP＜0.01，與生理鹽水組比較；*P＜0.01，As2 O3＋PTX與 As2 O3和紫杉醇單獨干預(yù)比較Fig.2 The effect of drugs induced cells apoptosisΔP＜0.01，compared with saline group；*P＜0.01，compared with As2 O3 group or paclitaxel group

圖3 透射電鏡觀察不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡形態(tài)Fig.3 Cell apoptosis induction and cellmorphology changing of A549 cell by different drugs

2.3 As2O3增強紫杉醇對A549細(xì)胞腫瘤球的生長抑制作用 腫瘤球的生長抑制實驗結(jié)果顯示，As2O3和紫杉醇均能抑制腫瘤球的生長。腫瘤球給藥7 d后，As2O3干預(yù)組、紫杉醇干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組分別使腫瘤體積減小到原體積的（77.35±2.31）%、（61.68±2.44）%和（44.85±3.34）%，生理鹽水組腫瘤球體積增大1.36倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖4）。

圖4 給藥7 d后腫瘤球體積變化**P＜0.01與生理鹽水組相比；ΔP＜0.05，As2 O3＋PTX與As2 O3和紫杉醇相比Fig.4 The change ratio of tumor spheroid after 7 days**P＜0.01，compared with saline group；ΔP＜0.05，compared with As2 O3 group or paclitaxel group

2.4 As2O3增強紫杉醇對肺癌異位瘤的生長抑制作用 荷瘤裸鼠治療實驗以生理鹽水組為對照，As2O3干預(yù)組、紫杉醇干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤生長的抑制率分別為（22.4±4.5）%、（39.5±6.2）% 和 （69.5±7.3）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合干預(yù)組與其他組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。

表1 不同藥物干預(yù)對腫瘤生長的抑制率（n＝5）Tab.1 The effect of different drugs inhibiting the growth of tumor（n＝5）

3 討論

紫杉醇是一種應(yīng)用廣泛的細(xì)胞毒性化療藥物，然而隨著治療的進(jìn)展也出現(xiàn)了一些腫瘤對紫杉醇耐藥［5］。As2O3具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡及細(xì)胞毒等作用，用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了突出的療效［6］。目前國內(nèi)外的研究者們對As2O3的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了廣泛而深入的研究，己證實As2O3不僅對血液系統(tǒng)腫瘤有效，其對實體瘤如肺癌、前列腺癌、白血病、胃癌和肝癌的生長和增殖均有抑制作用［7-11］。本研究聯(lián)合應(yīng)用As2O3和紫杉醇，考察聯(lián)合干預(yù)對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用。

本研究考察了As2O3聯(lián)合紫杉醇對肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，在降低紫杉醇給藥量的情況下，As2O3依然能夠增強紫杉醇對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，這說明As2O3與紫杉醇聯(lián)合干預(yù)能夠產(chǎn)生協(xié)同作用。這與劉洪義等將紫杉醇與As2O3聯(lián)合用于結(jié)腸腺癌的研究結(jié)果一致［12］。As2O3聯(lián)合紫杉醇對誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示與對肺癌細(xì)胞的增殖抑制實驗結(jié)果相一致。在某些實體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此抗腫瘤藥物很難進(jìn)入腫瘤組織深部［13-14］。本研究構(gòu)建了體外肺癌腫瘤球模型用于評價聯(lián)合給藥的抑制腫瘤生長的能力。結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，藥物干預(yù)能夠抑制腫瘤球的生長，聯(lián)合給藥比單獨給藥更能抑制腫瘤球的生長。荷瘤裸鼠的治療實驗結(jié)果顯示，當(dāng)降低紫杉醇給藥劑量后其與As2O3聯(lián)合給藥能夠達(dá)到比常規(guī)劑量的紫杉醇化療更好的抗肺癌療效，且低劑量聯(lián)合給藥對腫瘤生長的抑制作用顯著優(yōu)于紫杉醇干預(yù)組和As2O3干預(yù)組。因此，紫杉醇聯(lián)合As2O3不僅能夠高效抑制肺癌的惡性增殖，還能降低化療藥物的用量。

綜上，As2O3能夠有效增強紫杉醇對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，抑制腫瘤球和肺癌異位腫瘤的生長，是一種潛在的肺癌聯(lián)合治療手段。

［1］ Sugawara S，Maemondo M，Tachihara M，et al.Randomized phase II trial of uracil／tegafur and cisplatin versus vinorelbine and cisplatin with concurrent thoracic radiotherapy for locally advanced unresectable stage IIInon-small-cell lung cancer：NJLCG 0601［J］.Lung Cancer，2013，81（1），91-96.

［2］ Zhan C，Gu B，Xie C，et al.Cyclic RGD conjugated poly（ethyleneglycol）-co-poly（lactic acid）micelle enhances paclitaxel antiglioblastoma effect［J］.JControl Release，2010，143（1）：136-142.

［3］ Shah N，Chaudhari K，Dantuluri P，et al.paclitaxel-loaded PLGA nanparticles surfacemodified with transferrin and Pluronic_P85，an in vitro cell line and in vivo biodistribution studies on ratmodel［J］.J Drug Target，2009，17：533-542.

［4］ Ito K，Bernardi R，Morotti A，et al.PMI targeting eradicates quiescent leukaemia-initiating cells［J］.Nature， 2008， 453 （7198）：1072-1078.

［5］ Liu Y，Li K，Pan J，et al.Folic acid conjugated nanoparticles ofmixed lipid monolayer shell and biodegradable polymer core for targeted delivery of Docetaxel［J］.Biomaterials，2010，31（2）：330-338.

［6］ Han H，Qiu L，Wang X，et al.Physalins A and B inhibit androgenindependent prostate cancer cell growth through activation of cell apoptosis and down regulation of androgen receptor expression［J］.Biol Pharm Bull.2011，34（10）：1584-1588.

［7］ 王績英，王濤，曾錦榮，等.三氧化二砷聯(lián)合非諾貝特對人肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及E-cadherin／Snail轉(zhuǎn)化因子的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，34（14）：1406-1410.

［8］ 倪漸鳳，孫曉娟，張偉杰，等.三氧化二砷對前列腺癌DU-145細(xì)胞RASSF1A基因的去甲基化作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，34（7）：639-642.

［9］ Soriano-Hernandez AD，Galvan-Salazar HR，Montes-Galindo DA，et al.Antitumor effect ofmeclofenamic acid on human androgen-independent prostate cancer：a preclinicalevaluation［J］.IntUrolNephrol，2012，44（2）：471-477.

［10］ 徐爾迪，肖延風(fēng).三氧化二砷對人胃癌裸鼠移植瘤Flt－1、KDR和VEGFR-3表達(dá)的影響［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42（8）：943-946.

［11］ 李海燕，曹勵民，王娟.三氧化二砷對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（11）：2572-2574.

［12］ 劉洪義，王權(quán)，于金海，等.紫杉醇聯(lián)合三氧化二砷作用人結(jié)腸腺癌LS-174T細(xì)胞增殖及凋亡的實驗研究［J］.中國實驗診斷學(xué)雜志，2009，13（3）：324-326.

［13］ Xinyi Jiang，Xin H，Gu J，et al.Solid tumor penetration by integrinmediated pegylatedoly（trimethylene-carbonate）nanoparticles loaded with paclitaxel［J］.Biomaterials，2013，34（6）：1739-1746.

［14］ Li J，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an L，et al.Targeting the brain with PEGPLGA nanoparticlesmodified with phage-displayed peptides［J］.Biomaterials，2011，32（21）：4943-4950.

（編校：譚玲）

Effect of As2O3and paclitaxel on the proliferation of A549 cell and ectopic tumor grow th of nudem ice

WU Xiao-peng，LIU Xiao-min，LIU Qin，GUO Yan-zhen

（Department of Surgical Oncology，The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471039，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of As2O3combined with paclitaxel（PTX）on the treatment of lung cancer.MethodsThe antiproliferation efficiency of As2O3combined with PTX was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of As2O3combined with PTX.Transmission electron microscope（TEM）were used to observe the apoptosis morphous.A549 cell were xenografted in mice to establish the animalmodel，and the nude mices were devided into four groups，saline group，As2O3group，PTX group and As2O3＋PTX group.The animalmodelwere used to evaluate the effectofanti-tumor.The tumor size ofevery group weremeasured.HEwas used to observe the apoptosis of cancer cells.ResultsThe cell inhibition rate of A549 cellwere（3.35±0.21）%，（47.55±2.25）%，（64.64±3.35）%and（84.58±3.76）%after treatment with saline，As2O3，PTX and As2O3combined with PTX after 48h respectively（P＜0.01）.The early apoptosis rate of cancer cellswere0.26%，9.7%，17.8%and 42.5%for saline group，As2O3group，PTX and As2O3＋PTX group respectively（P＜0.01）.The final tumor spheroid volumes in saline group increased 1.36 times after 7 days.The final tumor spheroid volumes reduced to（77.35±2.31）%，（61.68±2.44）%and（44.85±3.34）%in As2O3，PTX and As2O3combined with PTX group respectively（P＜0.01）.The inhibition of lung cancer in vitro demonstrated the inhibition rate of tumor growth compared with saline group were（22.4±4.5）%，（39.5±6.2）%and（69.5±7.3）%for As2O3，PTX and As2O3＋PTX，respectively（P＜0.01）.ConclusionAs2O3combined with PTX can effectively inhibit the proliferation of A549 cellsand ectopic tumor growth in nudemice and itmay be a potentially effective treatment for lung cancer.

As2O3；paclitaxel；lung neoplasm；combination drug therapy；animalmodels

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0066－04

吳曉鵬，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤的生物治療研究，E-mail：wuxiaopeng147852＠163.com。