骨腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合肽修飾固體脂質(zhì)納米粒的腫瘤靶向性研究

宋玉光

（宜賓市第二人民醫(yī)院 骨科，四川 宜賓 644000）

骨腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合肽修飾固體脂質(zhì)納米粒的腫瘤靶向性研究

宋玉光

（宜賓市第二人民醫(yī)院 骨科，四川 宜賓 644000）

目的制備骨腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合肽—SLT肽修飾的固體脂質(zhì)納米粒（SLT peptidemodified solid lipid nanoparticles，SLT-SLNs），研究其與人骨肉瘤MG63細(xì)胞的親和力和腫瘤靶向性。方法細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)研究腫瘤細(xì)胞對(duì)SLT-SLNs的攝取。構(gòu)建骨腫瘤裸鼠異位模型，研究不同固體脂質(zhì)納米粒的體內(nèi)靶向性。結(jié)果SLT-SLNs的平均粒徑為（115.7±8.7）nm，多分散性系數(shù)為0.12，Zeta電位為（13±2.25）mV。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MG63細(xì)胞對(duì)SLT-SLNs的攝取效率是SLNs的4.4倍（P＜0.01）；體內(nèi)活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SLT-SLNs組荷瘤裸鼠腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于SLNs組。結(jié)論SLT肽修飾的固體脂質(zhì)納米粒具有良好的骨肉瘤細(xì)胞親和力，是一種潛在的高效骨腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。

骨腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合肽；SLT肽；固體脂質(zhì)納米粒；藥物靶向

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SizerNano ZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；聚氧乙烯50硬脂酸酯（Myrj53，Sigma，USA）；單硬脂酸甘油酯（成都科龍化工試劑廠）；雙十八烷基二甲基溴化銨膽固醇 DSPE-PEG2000-MAL（美國 Avanti polar lipids）；SLT肽（序列：SLTNLSK，上海吉爾生化公司合成）；香豆素-6（美國sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（美國sigma公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）。人骨肉瘤細(xì)胞（MG63，購自ATCC）。雄性裸鼠購自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCDX20120387.

1.2 方法

1.2.1 SLT-SLNs的制備與表征：參照Qin Y等［7］報(bào)道方法合成DSPE-PEG2000-SLT。精密稱取卵磷脂4mg，單甘脂2 mg，膽固醇2mg，聚氧乙烯50硬脂酸酯0.5mg，DDAB 2mg用氯仿充分溶解（30℃），然后在30℃的條件下減壓除去有機(jī)溶劑得到一層脂質(zhì)薄膜，接著水化薄膜，得到脂質(zhì)混合物，繼續(xù)用探頭超聲（60W，30 s）進(jìn)行分散，得到SLT-SLNs。在磷脂材料中加入適量的香豆素-6或者DIR，得到香豆素-6或DIR標(biāo)記的SLT-SLNs。

取適量SLT-SLNs滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色10 s后用濾紙吸去多余的染液，自然干燥后，用透射電鏡觀察其輪廓和形態(tài)并拍照。

1.2.2 MG63細(xì)胞對(duì)SLT-SLNs的攝?。簩G63細(xì)胞按照1×105細(xì)胞／孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，在孔板中加入香豆素-6標(biāo)記的SLT-SLNs和SLNs，每個(gè)孔加入100 uL，于5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育2 h和4 h，棄去培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞熒光值。

為定性觀察細(xì)胞對(duì)固體脂質(zhì)納米粒的攝取情況，將固體脂質(zhì)納米粒與細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2μg／mL DAPI溶液，室溫孵育20min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3 活體成像實(shí)驗(yàn)觀察SLT-SLNs在荷瘤裸鼠腫瘤組織腫瘤細(xì)胞內(nèi)分布：MG63細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個(gè)／m L。取4～6周齡，體質(zhì)量20～25g的雄性裸鼠，將準(zhǔn)備好的MG63細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 mL細(xì)胞懸濁液。接種后1周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。取荷瘤裸鼠，尾靜脈注射載DIR的SLT-SLNs和SLNs，24 h后置于活體成像儀下觀察固體脂質(zhì)納米粒的體內(nèi)分布（Ex＝730，Em＝790）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLT-SLNs的表征 取制備得到的SLT-SLNs用馬爾文激光粒度儀測(cè)定粒度和Zeta電位，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示SLTSLNs的平均粒徑為（115.7±8.7）nm，多分散性系數(shù)為0.12，Zeta電位為（13±2.25）mV。透射電鏡結(jié)果顯示：所制備的固體脂質(zhì)納米粒的形態(tài)均呈球形，比較規(guī)則，圓整，大小比較均一（見圖1）。

圖1 透射電鏡下的SLT-SLNsFig.1 SLT-SLNs visualized by transmission electron microscopy（TEM）

2.2 MG63細(xì)胞對(duì)SLT-SLNs的攝取情況 細(xì)胞攝取定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MG63細(xì)胞對(duì)SLT-SLNs的攝取效率是SLNs的4.4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明SLT肽對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有高親和性；加入SLT肽后，MG63細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取效率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明游離的SLT肽能對(duì)SLT-SLNs的攝取產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制。MG63細(xì)胞在4h對(duì)SLT-SLNs的攝取效率是SLNs的2.37倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖2）。激光共聚焦結(jié)果顯示，SLT-SLNs組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于SLNs組（見圖3），與定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖2 MG63細(xì)胞對(duì)固體脂質(zhì)納米粒的攝取效率*P＜0.01，與 SLNs相比；＃P＜0.01，與 SLT-SLNs＋60μg SLT相比；ΔP＜0.01，與2 h的攝取相比Fig.2 Uptake of SLNs by MG63 cells*P＜0.01，compared with SLNs；＃P＜0.01，compared with SLT-SLNs＋60μg SLT；ΔP＜0.01，compared with SLT-SLNs at2 hour

圖3 激光共聚焦觀察MG63細(xì)胞對(duì)香豆素-6標(biāo)記固體脂質(zhì)納米粒的攝取.Fig.3 Uptake of coumarin-6 labelled SLNs by MG63 cells based on confocal laser scanningmicroscopy

2.3 SLT-SLNs在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況 荷瘤裸鼠活體熒光成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：給藥24 h后，SLT-SLNs在荷瘤小鼠腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于SLNs組（黃色熒光越強(qiáng)表明脂質(zhì)體濃度越高，見圖4）。說明經(jīng)過SLT肽修飾后，固體脂質(zhì)納米粒具有了一定的骨肉瘤主動(dòng)靶向性。

圖4 載DIR的不同固體脂質(zhì)納米粒在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布Fig.4 EX vivo images of distribution of various DIR loaded SLNs and SLT-SLNs

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性腫瘤，具有高度易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，早期的診斷和治療尤為重要。探尋新的骨肉瘤靶向治療靶點(diǎn)可以為骨肉瘤的診斷和治療提供新方向。SLT肽是通過噬菌體展示技術(shù)得到的新型的與骨肉瘤細(xì)胞具有特異性親和力的短肽。已有研究證實(shí)SLT肽能夠與骨肉瘤細(xì)胞特異性的結(jié)合。然而SLT肽對(duì)骨肉瘤細(xì)胞卻沒有表現(xiàn)出顯著的抑制作用［8］。本研究以固體脂質(zhì)納米粒為載體，將SLT肽連接到固體脂質(zhì)納米粒表面，研究其與腫瘤細(xì)胞的親和力和腫瘤靶向性。

本研究制備的SLT-SLNs的粒徑在110 nm左右。有研究表明，當(dāng)納米給藥系統(tǒng)的粒徑在50～200 nm范圍內(nèi)時(shí)，能夠有效的通過EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的高效蓄積［9-11］。有部分通過噬菌體展示技術(shù)獲得的具有腫瘤細(xì)胞特異性多肽能夠與腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合，但當(dāng)連接到納米載體表面后卻失去了活性，這可能是在化學(xué)修飾過程中多肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化所致［12-13］。本研究通過細(xì)胞攝取研究SLT肽連接到固體脂質(zhì)納米粒表面后與骨肉瘤細(xì)胞的親和力，結(jié)果顯示：骨肉瘤MG63細(xì)胞對(duì)經(jīng)過SLT肽修飾后的固體脂質(zhì)納米粒攝取顯著強(qiáng)于未修飾的固體脂質(zhì)納米粒（P＜0.01）。這說明SLT肽修飾到固體脂質(zhì)納米粒表面后，保持了活性。定量的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，游離的SLT肽能夠?qū)LT-SLNs的攝取產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在體內(nèi)分布定性研究中，采用動(dòng)物活體成像儀定性觀察藥物在動(dòng)物體內(nèi)分布，是目前研究藥物在動(dòng)物體內(nèi)分布較為快速，準(zhǔn)確，直觀的新技術(shù)［14］。近紅外染料穿透力強(qiáng)，干擾小，靈敏度高，廣泛用于小動(dòng)物活體成像研究［15-17］。本研究選用近紅外染料DIR定性考察所構(gòu)建的固體脂質(zhì)納米粒在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果表明，SLTSLNs在腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于SLNs。這與體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

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（編校：吳茜）

Study on osteosarcoma targeting of solid lipid nanoparticlesmodified w ith peptides specifically binding to human osteosarcoma cells

SONG Yu-guang

（Department of Orthopedics，The Second People's Hospital of Yibin，Yibin 644000，China）

ObjectiveTo prepare SLT peptide modified solid lipid nanoparticles（SLT-SLNs），study on its affinity to MG63 cell and tumor targeting.MethodsCellular uptake testwas used to evaluate the uptake efficiency of MG63 cell for SLT-SLNs.MG63 cellwere xenografted into athymic nudemice to establish the animalmodel，vivo imaging was used to evaluate the targeting efficiency.ResultsThe average particle size of SLT-SLNswas（115.7±8.7）nm，polydispersity coefficient was 0.12，and Zeta potential was（13±2.25）mV.Cellular uptake test results showed that uptaken efficiency of SLTmodified SLNs by MG63 cellwere 4.4 times higher than that of SLNs.The fluorescence intensity of SLT-SLNswasmuch stronger than that of SLNs in vivo.ConclusionThe SLT peptidemodified solid lipid nanoparticles has a good osteosarcoma targeting efficiency，and itmight serve as a promising osteosarcoma delivery system of antitumor drugs.

peptides specifically binding to osteosarcoma cells；SLT peptides；solid lipid nanoparticles；drug targeting

R738

A

1005－1678（2014）04－0053－03

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占原發(fā)惡性骨腫瘤的22.36%［1］。目前對(duì)骨肉瘤的治療主要有手術(shù)治療和藥物化療?；熕幬镉捎谌狈Π邢蛐裕沂褂脛┝科毡槠?，對(duì)患者其他組織或器官正常細(xì)胞易引起嚴(yán)重不良反應(yīng)［2-3］。靶向給藥系統(tǒng)是指借助載體、配體或抗體將藥物通過局部給藥胃腸道、或全身血液循環(huán)而選擇性地濃集定位于靶組織、靶器官、靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)［4-5］。固體脂質(zhì)納米粒是靶向給藥系統(tǒng)的代表，具有可控制藥物釋放、避免藥物降解或泄漏及良好的靶向性等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。SLT肽是一種序列為SLTNLSK的短肽，它能夠與骨肉瘤細(xì)胞特異性結(jié)合［8］，目前尚無SLT連接到納米載體表面抗腫瘤的報(bào)道。本研究將末端進(jìn)行了半胱氨酸修飾的SLT肽連接到固體脂質(zhì)納米粒表面，研究其與骨肉瘤細(xì)胞的親和力以及骨肉瘤靶向性，為骨肉瘤的靶向治療研究提供理論依據(jù)。

宋玉光，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：骨科腫瘤疾病，E-mail：doctorsongyg＠163.com。