蟲草復合營養(yǎng)液對過氧化氫致PC12細胞損傷的保護作用研究

郝春艷

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 護理部，遼寧 錦州 121001）

蟲草復合營養(yǎng)液對過氧化氫致PC12細胞損傷的保護作用研究

郝春艷

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 護理部，遼寧 錦州 121001）

目的研究蟲草復合營養(yǎng)液對過氧化氫損傷的PC12細胞的保護作用。方法P12細胞分為陰性對照組、造模組、低濃度組（1%蟲草復合營養(yǎng)液）、中濃度組（3%蟲草復合營養(yǎng)液）和高濃度組（5%蟲草復合營養(yǎng)液），培養(yǎng)24h后除陰性對照組外，其他各組加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24h，比較各組細胞存活率、LDH活性以及NO含量。結果造模組存活率為（62.8±4.2）%，陰性對照組存活率為（100.0±1.7）%，造模組顯著低于陰性對照組（P＜0.01），加入復合營養(yǎng)液組細胞存活率較造模組顯著升高（P＜0.01），細胞LDH水平以及NO含量，造模組與陰性對照組比較，均顯著高于陰性對照組（P＜0.01），加入復合營養(yǎng)液后，LDH水平以及NO含量較造模組顯著下降（P＜0.01）。結論蟲草復合營養(yǎng)液對氧化應激損傷的PC12細胞具有保護作用。

蟲草復合營養(yǎng)液；過氧化氫；P12細胞

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株，由上海艾研生物科技有限公司提供，蟲草復合營養(yǎng)液由本實驗室配制，主要成分為蟲草、猴頭、靈芝。配制方法：3種食用菌發(fā)酵后提取發(fā)酵液及菌絲體，混合，粉碎，膠體磨破碎，離心，超聲波處理，獲得發(fā)酵液及菌絲體混合物。NO試劑盒（拜力生物），LDH試劑盒（上海谷研試劑有限公司）。PT-3502型酶標儀（北京普天），TGL-16M低溫離心機（馳騁華星科技有限公司），BSC-1300IIA2生物安全柜（百典），Touch190 CO2培養(yǎng)箱（瑞士康科技），S-2低壓吸引器（寧波戴維醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試劑及培養(yǎng)基配制：配制濃度10mM的過氧化氫溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基，10%高滲鹽水，5%FBSDMEM培養(yǎng)基，4℃保存。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：將PC12細胞置于10%HS，5%FBSDMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞從液氮罐中取出，解凍，吸出細胞懸液，加入培養(yǎng)基，吹打混勻，離心后，棄去上清，再次加入培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 分組：低劑量組加入1%的復合營養(yǎng)液，中劑量組加入3%的復合營養(yǎng)液，高劑量組加入5%的復合營養(yǎng)液，另設H2O2造模組和陰性對照組。取對數生長期的細胞，配制成1×105個／mL，接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的復合營養(yǎng)液，造模組和陰性對照組加入PBS液。培養(yǎng)24 h。取10 mM過氧化氫溶液16mL，加PBS液24mL，配制10mM濃度，除陰性對照組外，將配制好的H2O2加入各組，使終濃度為400 nM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測指標 MTT法檢測各組細胞的存活率，酶標儀550 nm處測定OD值，計算存活率。檢測細胞LDH活性，用以反映細胞的受損情況，440 nm，測定吸光度，計算LDH活力。測定細胞NO含量，洗取細胞上清液，通過OD值計算上清液中NO的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0對數據進行分析，正態(tài)計量資料采用“±s”表示，多組間比較采用F檢驗以及t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 造模組細胞存活率顯著低于陰性對照組（P＜0.01），加入復合營養(yǎng)液后，細胞存活率較造模組顯著升高（P＜0.01），并且隨著藥物濃度的增加，細胞的存活率也逐漸升高（P＜0.01，見表1）。

表1 各組細胞存活率比較Tab.1 Comparison of cell viability in each group

2.2 各組細胞LDH活性比較 造模組LDH水平較陰性對照組顯著升高，而加入復合營養(yǎng)液組LDH水平較造模組顯著下降（P＜0.01）。但是隨著復合營養(yǎng)液濃度的增加，LDH水平有所升高，這可能與復合營養(yǎng)液濃度升高后對細胞有一定的損害，而導致部分細胞LDH滲漏有關（見表2）。

表2 各組細胞LDH活性比較Tab.2 Comparison of LDH activity in each group

2.3 各組細胞上清液NO含量比較 造模組上清液NO含量較陰性對照組顯著升高（P＜0.01），加入復合營養(yǎng)液組NO含量較造模組顯著下降（P＜0.01），并且隨著濃度的增加，下降幅度越大（見表3）。

表3 各組上清液NO含量比較Tab.3 Comparison of NO in each group

3 討論

蟲草屬于寄生真菌的一種，隸屬于子囊菌亞門、核菌綱、肉座菌目，目前發(fā)現的已經有400多種，其中許多種類都包含有重要的要用價值。其在中醫(yī)中的應用歷史悠久，具有低脂、高蛋白、低熱等優(yōu)點［4］。大量研究顯示蟲草具有抗腫瘤、提高免疫力、降低血脂、調節(jié)代謝等作用［5］。其通過提高單核-巨噬細胞的吞噬作用、促進器官的蛋白更新等作用調節(jié)免疫功能。蟲草還能夠提高血清IgM的水平、IgG的水平，從而調節(jié)體液免疫［6］。

本研究中所采用的蟲草復合營養(yǎng)液主要成分為蟲草、靈芝以及猴頭菌。猴頭菌和靈芝也是屬于我國傳統(tǒng)上名貴的食用菌種。猴頭菌具有促進神經生長因子的表達、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等作用。蟲草富含蟲草素、多糖、蟲草酸等，對抗腫瘤、提高免疫力、促進內循環(huán)等具有重要的作用。靈芝富含靈芝多肽和靈芝多糖，具有延緩衰老、抗腫瘤的作用。

腦組織中腦神經元的膜結構由大量的不飽和脂肪酸，腦組織中鐵離子的濃度高，并且抗氧化酶水平較低，因此腦組織更容易遭受反應性氧化的損傷。研究顯示多種神經退行性疾病與氧化應激相關，包括帕金森病和阿爾茲海默?。?-8］。PC12細胞源于神經系統(tǒng)外胚層，其特征與多巴胺能神經元相似，因具有可傳代的優(yōu)點，因此廣泛被用于神經系統(tǒng)相關領域的研究。本研究目前使用的PC12細胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株。

神經退行性病變是困擾老年患者的主要疾病，包括帕金森病以及阿爾茲海默病，目前尚無有效的治療方法。研究顯示當神經細胞受到反應性氧化攻擊時，神經細胞會發(fā)生凋亡，導致神經元網絡發(fā)生功能紊亂，最終導致神經退行性疾?。?］。阿爾茲海默病與腦神經細胞突觸退變以及神經元的死亡具有密切的關系，膜脂質大量不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，導致細胞膜運輸ATP酶、葡萄糖以及谷氨酸轉運子的功能損傷，細胞膜發(fā)生去極化，ATP耗竭，鈣離子大量內流，導致線粒體功能障礙，從而導致β-淀粉樣蛋白的堆積［10-11］。帕金森病的發(fā)病機制是多巴胺能神經元發(fā)生氧化應激，線粒體功能障礙，而氧化應激是導致帕金森病患者黑質神經元死亡的主要原因［12］。

H202廣泛用于抗氧化的研究中。多巴胺氧化、淀粉蛋白聚集、腦缺血再灌注等均可產生大量的H202，而H202還可進一步轉化為OH-，其毒性更大，可通過氧化神經細胞膜中的不飽和脂肪酸脂質而使細胞膜遭到破壞，還通過損傷DNA、蛋白質等誘導細胞凋亡［13］。因復合營養(yǎng)液中既含有促進細胞生長的成分，也含有抑制細胞生長的成分，因此本研究中，參考既往文獻的研究結果，當復合菌液濃度超過5%時，其抑制作用比較明顯，選擇＜5%的濃度來研究復合菌液對氧化損傷的PC12細胞的保護作用。

在本研究中，造模組細胞存活率顯著低于陰性對照組，細胞LDH水平、NO含量顯著高于陰性對照組。說明H2O2對PC12細胞具有損傷作用，能夠降低細胞的存活率。LDH和NO能夠反映細胞受損的情況。加入不同濃度的復合營養(yǎng)液組其細胞存活率顯著升高，而LDH水平以及NO含量也顯著下降，說明復合營養(yǎng)液對H2O2損傷的PC12細胞具有保護作用。另外，本研究還發(fā)現，伴隨著復合營養(yǎng)液濃度的不斷增加，相應的細胞的存活率也呈現出逐漸升高的趨勢，而NO含量逐漸下降，說明其對氧化應激損傷的PC12細胞的保護作用具有一定的濃度依賴性。但是濃度為1%的復合營養(yǎng)液組LDH水平最低，而隨著濃度增加，LDH水平也逐漸增加，這可能是因為隨著復合營養(yǎng)液濃度的增加，會對細胞產生一定的損害作用，從而導致部分細胞發(fā)生LDH滲漏。蟲草具有抗氧化應激的作用，冬蟲夏草對超氧陰離子自由基和羥自由基具有清除作用。具有抗脂質過氧化的作用，對體外細胞的氧化應激損傷具有保護作用。付健陽等［14］研究發(fā)現，蟲草通過改善機體微循環(huán)及氧化應激水平，調節(jié)血脂水平等對1型糖尿病大鼠腎臟發(fā)揮保護作用。李風華等［15］研究發(fā)現，蟲草菌絲能夠顯著大鼠肝纖維化模型大鼠超氧化物歧化酶（SOD）的活性，從而發(fā)揮抗氧化應激的作用。

綜上所述，蟲草復合營養(yǎng)液對體外PC12細胞的氧化應激具有保護作用，抑制LDH的滲漏，并降低上清中的NO水平，但是蟲草復合液中既含有促進細胞生長成分，也含有抑制細胞生長的成分，因此要根據不同的目的，選擇適合的濃度。

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（編校：吳茜）

Study on the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution in hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury

HAO Chun-yan

（Department of Nursing，First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China）

ObjectiveTo study the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution on hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury.MethodsP12 cellswere divided into negative control group，model group，low-dose group（1%Cordyceps complex nutrient solution），middle dose group（3%Cordyceps complex nutrient solution）and high-dose group（5%Cordyceps complex nutrient solution）.After 24 h cultured，except the negative control group，other groups were added H2O2and cultured for another 24h.Cell viability，LDH activity and NO were compared in each group.ResultsSurvival rate inmodel group was（62.8±4.2）%，the survival rate of the negative control group was（100.0±1.7）%，the survival rate in themodel group was significantly lower than that in negative control group（P＜0.01），and cell viability increased significantly in composite nutrient solution group compared withmodel group（P＜0.01）.Cellular LDH levels and NO content in themodel group and negative control group were significantly higher than that in negative control group（P＜0.01），which decreased significantly when added cordyclps composite nutrient solution（P＜0.01）.ConclusionCordyceps composite nutrient solution shows protective effect on hydrogen peroxide in PC12 cells.

Cordyceps；nutrient solution；H2O2；PC12 cells

R282.71

A

1005－1678（2014）04－0050－03

當氧化物的水平超過機體內源性抗氧化作用的時候，會導致分子氧化，組織損傷，此為氧化應激。腦組織中，腦神經元的膜結構由高濃度的不飽和脂肪酸組成，并且腦組織中的抗氧化酶水平較低，因此腦組織容易受到過氧化物的損傷。研究顯示，氧化應激與帕金森病、老年癡呆等神經退行性疾病相關［1-2］。蟲草具有抗氧化的作用，能改善體外細胞過氧化氫含量、過氧化氫酶活力等，蟲草素還具有清除自由基的作用［3］。P12細胞和多巴胺神經元相似，來源于神經系統(tǒng)外胚層。本文對蟲草復合營養(yǎng)液損傷在過氧化氫致P12細胞中的作用進行了探討。

遼寧省科技廳課題（201101575）

郝春艷，女，碩士，教授、主任護師、碩士研究生導師，研究方向：臨床護理、護理管理，E-mail：21127026＠qq.com。