血清I-FABP在診斷膿毒癥大鼠急性腸功能障礙中的作用及谷氨酰胺對(duì)其表達(dá)的影響

關(guān)云艷，沈麗娟，吳錫平，王倩，吳海榮，肖濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫醫(yī)院，ICU，江蘇 無(wú)錫 214071）

血清I-FABP在診斷膿毒癥大鼠急性腸功能障礙中的作用及谷氨酰胺對(duì)其表達(dá)的影響

關(guān)云艷，沈麗娟，吳錫平，王倩，吳海榮，肖濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫醫(yī)院，ICU，江蘇 無(wú)錫 214071）

目的探討血清脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）在膿毒癥鼠腸功能障礙評(píng)估中的作用及谷氨酰胺對(duì)其表達(dá)水平的影響。方法以健康SD大鼠腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立膿毒癥模型，隨機(jī)分為3組，對(duì)照組不建模，僅給予百普素喂養(yǎng)，模型組建模后給予百普素喂養(yǎng)，谷氨酰胺組建模后同時(shí)給予百普素和谷氨酰胺喂養(yǎng)。評(píng)估血清I-FABP濃度與腸粘膜損傷指數(shù)的相關(guān)性及比較3組大鼠血清I-FABP含量。結(jié)果血清I-FABP濃度與腸粘膜損傷指數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，模型組和谷氨酰胺組血清I-FABP濃度均明顯增高（P＜0.05）；而谷氨酰胺組中血清I-FABP濃度顯著低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論血清I-FABP可作為膿毒癥腸功能障礙評(píng)估的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)；谷氨酰胺能改善膿毒癥鼠的腸粘膜的損傷程度。

腸脂肪酸結(jié)合蛋白；急性腸功能障礙；谷氨酰胺

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 30只雄性SD大鼠（6月齡，體質(zhì)量140～160 g，由上海市西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證編號(hào)：SYXK（軍）2007-030。隨機(jī)分為正常組10只（A組），百普素組36 h（B1組），72 h（B2組）各5只，谷氨酰胺組10只（C組）。

1.2 動(dòng)物模型制作及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 w，正常組大鼠腹腔注射生理鹽水，百普素組大鼠腹腔注射0.45mg／mL的脂多糖 （LPS，SIGAMA公司）1 mL／100 g，即4.5mg／kg。腹腔注射10 min內(nèi)分3次注射完畢。造模后12 h給予灌注百普素（PEPTI-2000 variant）溶液，濃度為 25.2%（80 kcal），每次4mL，5次／d。谷氨酰胺組大鼠在模型組基礎(chǔ)上加喂谷氨酰胺（SIGAMA公司）3.75 g／（kg·d）。各組終點(diǎn)時(shí)（除B1組為36 h外，其他組實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)均為72 h）從大鼠眼眶靜脈叢取血后處死，所取靜脈血，13 000 r／min離心10min后取血清，用1mL離心管分裝后，放入－80℃冰箱保存，待統(tǒng)一檢測(cè)。同時(shí)，取回腸組織做病理檢測(cè)。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.1 I-FABP檢測(cè)：取0.1mL血清，用固相夾心酶聯(lián)免疫吸附法（I-FABPELISA試劑盒，上海滬峰化工有限公司生產(chǎn)）統(tǒng)一檢測(cè)I-FABP濃度。方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 病理檢測(cè)：所有大鼠動(dòng)物頸錐脫臼處死，取小腸用10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋。切片經(jīng)HE染色。①光學(xué)顯微鏡（日本Olympus DX45）觀察：腸壁絨毛有無(wú)水腫，粘膜上皮細(xì)胞有無(wú)變性、壞死，粘膜固有層有無(wú)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層、肌層、漿膜層有無(wú)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。按Chiu氏6級(jí)評(píng)分［3］根據(jù)病變由輕到重的程度，依次評(píng)為1～5分，無(wú)明顯病變?yōu)?分。②用圖像分析軟件（顯微鏡自帶計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)DP2-BSW）測(cè)量腸壁絨毛長(zhǎng)度，粘膜層厚度，求出每只動(dòng)物平均絨毛長(zhǎng)度與粘膜層厚度的比值（絨毛長(zhǎng)度／粘膜層厚度）和粘膜層平均厚度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)于符合正態(tài)分布的資料用“±s”表示，組間比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗(yàn)；各指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清 I-FABP水平比較 B1組、B2組、C組血清I-FABP濃度均顯著高于A組（P＜0.05）；同時(shí)B1組、B2組血清I-FABP濃度顯著高于 C組（P＜0.05），此外，B2組血清 I-FABP濃度也顯著高于B1組（P＜0.01，見(jiàn)表1）。

表1 血清I-FABP水平比較Tab.1 Comparision of serum I-FABP in different groups

2.2 組織病理檢測(cè)結(jié)果 對(duì)回腸粘膜絨毛長(zhǎng)度及粘膜層厚度的測(cè)量結(jié)果及對(duì)腸粘膜進(jìn)行Chiu氏評(píng)分結(jié)果顯示A組10只Chiu氏6級(jí)評(píng)分均為0分；B1組評(píng)分為1分，其它4只為0分；B2組1只Chiu氏評(píng)分為3分，1只為2分，2只為1分，1只0分；C組中6只 Chiu氏評(píng)分為1分，2只2分，2只為0分。根據(jù)病理結(jié)果，B1組、B2組、C組的腸粘膜Chiu氏評(píng)分與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示造模成功，此外，B1組、B2組、C組的腸粘膜絨毛長(zhǎng)度、粘膜層厚度與A組比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但B1組、B2組、C組之間的腸粘膜絨毛長(zhǎng)度、粘膜層厚度及腸粘膜Chiu氏評(píng)分的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表2）。

表2 回腸粘膜形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Histopathology results of intestinalmucosa

2.3 血清I-FABP濃度與腸粘膜Chiu氏評(píng)分的相關(guān)性分析

血清I-FABP濃度與腸粘膜Chiu氏評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系（rs＝0.589，p＝0.000 6），與腸粘膜絨毛長(zhǎng)度、粘膜層厚度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝-0.371，p＝0.044；r＝-0.438，p＝0.016，見(jiàn)圖1）。

圖1 血清I-FABP濃度與腸粘膜Chiu氏評(píng)分（a）、腸粘膜絨毛長(zhǎng)度（b）和粘膜層厚度（c）的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation between I-FABP and Chiu's score of intestinal mucosa（a），mucosa thicknes（b）and villus length（c）

3 討論

正常功能的腸上皮細(xì)胞對(duì)于維持及改善營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、確保粘膜完整性以抵抗微生物的侵襲是至關(guān)重要的。但是腸道尤其是腸絨毛頂端網(wǎng)囊狀微血管結(jié)構(gòu)對(duì)缺血極為敏感，所以腸道缺血后首先受損的就是腸絨毛頂端。缺血時(shí)腸道結(jié)構(gòu)和功能的變化有以下幾個(gè)方面：①腸粘膜通透性增加導(dǎo)致了細(xì)菌移位；②局部免疫激活導(dǎo)致了全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）；③腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致了吸收障礙、不能耐受食物；這幾方面綜合起來(lái)就促進(jìn)了多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)生和發(fā)展［1-2］。因此腸道功能障礙的早期診斷及處理，對(duì)降低MODS的發(fā)生率及死亡率具有重要意義。但目前缺乏簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、客觀的評(píng)估腸道功能障礙的方法。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP）是一組細(xì)胞內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)，分子量為12～15 kDa。其種類繁多，包括心型、腸型、肝型、腦型、肌肉型、脂肪細(xì)胞型等，而腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）僅位于腸道的上皮細(xì)胞內(nèi)，在小腸的全長(zhǎng)范圍都可檢測(cè)到其mRNA的表達(dá)［3］，尤其在近端回腸表達(dá)程度最高，該蛋白與甘油三酯的合成及分泌有關(guān)［4］，并受食物中長(zhǎng)鏈脂肪酸的正向調(diào)節(jié)［5］，當(dāng)腸上皮細(xì)胞完整性破壞時(shí)可迅速釋放入血液循環(huán)中，故在缺血-再灌注損傷、腸道化學(xué)性毒物的損傷及腸移植排斥反應(yīng)中，血清I-FABP的表達(dá)增高［6-7］，且其表達(dá)水平與小腸粘膜通透性及細(xì)菌移位程度明顯相關(guān)［8］。

近年來(lái)，作為腸粘膜重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)-谷氨酰胺的藥理作用越來(lái)越受到重視。目前認(rèn)為，谷氨酰胺可以降低腸粘膜的通透性，維持腸道粘膜的結(jié)構(gòu)完整性，減少腸道細(xì)菌易位，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的更新速度及修復(fù)能力［9-11］。最近研究顯示，谷氨酰胺還能夠降低中性粒細(xì)胞趨化因子、腫瘤壞死因子的表達(dá)，降低髓過(guò)氧化物酶活性、淋巴細(xì)胞毒性及增加Foxp3＋、CD4＋、CD25＋調(diào)節(jié)性細(xì)胞的數(shù)量，從而減輕腸粘膜的炎癥反應(yīng)［12-14］。此外，還可通過(guò)抑制表達(dá)T細(xì)胞抗原受體的腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的凋亡，下調(diào)表達(dá)T細(xì)胞抗原受體的腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)而減輕腸粘膜損傷的程度［15］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：膿毒癥鼠血清I-FABP的表達(dá)程度與腸粘膜Chiu氏評(píng)分呈正相關(guān)，與腸黏膜絨毛長(zhǎng)度及厚度呈負(fù)相關(guān)性，故血清I-FABP的水平可用于評(píng)估膿毒癥誘發(fā)的急性腸功能障礙；且在百普素喂養(yǎng)組中72 h時(shí)所測(cè)得的I-FABP水平明顯高于36 h組，分析可能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠腸功能障礙程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。此外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到雖然谷氨酰胺組中腸粘膜Chiu氏評(píng)分、腸黏膜絨毛長(zhǎng)度及厚度與非谷氨酰胺喂養(yǎng)組相比無(wú)顯著性差異，但谷氨酰胺組中的血清I-FABP水平明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明對(duì)膿毒癥鼠給予谷氨酰胺干預(yù)后能降低其血清IFABP濃度，分析可能與谷氨酰胺的降低腸粘膜炎癥反應(yīng)有關(guān)，但確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Piton G，Manzon C，Cypriani B，et al.Acute intestinal failure in critically ill patients：is plasma citrulline the right marker？［J］.Intensive Care Med.，2011，37（6）：911-917.

［2］ Li JY，Sun D，Lu Y，etal.Change in intestinal function in sepsis in rat［J］.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2004，16（6）：352-354.

［3］ Ockner RK.Historic overview of studies on fatty acid-binding proteins［J］.Mol Cell Biochem.1990，98（1-2）：3-9.

［4］ Besnard P，Niot I，Poirier H，et al.New insights into the fatty acidbinding protein（FABP）family in the small intestine［J］.Mol Cell Biochem，2002，239（1-2）：139-147.

［5］ Mochizuki K，Suruga K，Yagi E，et al.The expression of PPAR-associated genes ismodulated through postnatal development of PPAR subtypes in the small intestine［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1531（1-2）：68-76.

［6］ Niewold TA，Meinen M，van der Meulen J.Plasma intestinal fatty acid binding protein（I-FABP）concentrations increase following intestinal ischemia in pigs［J］.Res Vet Sci，2004，77（1）：89-91.

［7］ Pelsers MM，Hermens WT，Glatz JF.Fatty acid-binding proteins as plasmamarkers of tissue injury［J］.Clin Chim Acta，2005，352（1-2）：15-35.

［8］ Rahman SH，Ammori BJ，Holmfield J，et al.Intestinal hypoperfusion contributes to gut barrier failure in severe acute pancreatitis［J］.J Gastrointest Surg，2003，7（1）：26-35.

［9］ Singleton KD，Serkova N，Beckey VE，et al.Glutamine attenuates lung injury and improves survival after sepsis：role of enhanced heat shock protein expression［J］.Crit Care Med，2005，33（6）：1206-1213.

［10］ Roth E.Nonnutritive effects of glutamine［J］.JNutr，2008，138（10）：2025S-2031S.

［11］ Ban K， Kozar RA.Glutamine protects against apoptosis via downregulation of Sp3 in intestinal epithelial cells［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2010，299（6）：G1344-1353.

［12］ LiN，Liboni K，F(xiàn)ang MZ，etal.Glutamine decreases lipopolysaccharide induced intestinal inflammation in infant rats［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physio，2004，286（6）：G914-921.

［13］ Wang X，Xue Y，Liang M，et al.Glutamine treatment decreases plasma and lymph cytotoxicity during sepsis in rats［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44（9）：774-782.

［14］ Song EK，Yim JM，Yim JY，et al.Glutamine protectsmice from acute graft-versus-host disease（aGVHD）［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，435（1）：94-99.

［15］ Tung JN，Lee WY，Pai MH，et al.Glutamine modulates CD8αα（＋）TCRαβ（＋）intestinal intraepithelial lymphocyte expression in mice with polymicrobial sepsis［J］.Nutrition，2013，29（6）：911-917.

（編校：吳茜）

Role of I-FABP in the diagnose of acute intestinal dysfunction rats w ith sepsis and effect of glutam ine on its expression

GUAN Yun-yan，SHEN Li-juan，WU Xi-ping，WANG Qian，WU Hai-rong，XIAO Tao

（Department of ICU，Nanjing University of Chinese Medicine Affiliated ofWuxi Hospital，Wuxi214071，China）

ObjectiveTo investigate the role of intestinal fatty acid binding protein（I-FABP）in evaluating intestinal dysfunction of septic rats and the effect of glutamine on I-FABP expression.MethodsRatswere divided into 3 groups，control group were only fed with Peptisorb，model group were fed with Peptisorb after intraperitoneal injection with E.coli endotoxin lipopolysaccharidegiven and glutamine group were added glutamine on basis of model group.The correlation between serum I-FABP level and intestinalmucosa damage index were analyzed and the concentrations of serum I-FABP in each group were observed and compared.ResultsThe serum level of I-FABP in ratswere correlated with the Chiu's score of intestinalmucosa，mucosa thickness and villus length（P＜0.05）.Compared with control group，the concentration of serum I-FABP in model group and glutamine group were significantly increased（P＜0.05），butwhich in glutamine group was lower than that in model group（P＜0.05）.Conclusions Serum I-FABP could be an non-invasive diagnosis index for evaluating acute intestinal dysfunction in septic rats.In addition，dietary glutamine supplementation may ameliorate sepsis-induced intestinal epithelial injury in rats.

intestinal fatty acid binding protein（I-FABP）；acute intestinal dysfunction；glutamine

R392.5

A

1005－1678（2014）04－0044－03

目前已知，腸道對(duì)缺血的損傷極為敏感，因?yàn)閮?nèi)臟血流灌注高度依賴于心輸出量，休克、燒傷、創(chuàng)傷、膿毒癥等所引起的血液動(dòng)力學(xué)的改變及血流重分布極易影響到內(nèi)臟的供血，而且有研究顯示在動(dòng)脈血壓未下降之前就已經(jīng)有內(nèi)臟血管的收縮及消化道低灌注的發(fā)生，所以早期評(píng)估腸道功能并及早進(jìn)行干預(yù)將有利于患者的預(yù)后。本研究通過(guò)構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，檢測(cè)血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）水平及觀察腸粘膜組織病理學(xué)改變來(lái)評(píng)價(jià)血清I-FABP在診斷膿毒癥大鼠急性腸功能障礙中的作用及谷氨酰胺對(duì)I-FABP表達(dá)的影響。

江蘇省無(wú)錫市科技局立項(xiàng)課題（GSZOON1119）

關(guān)云艷，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：危重病的診斷及治療，E-mail：guanyuy＠163.com。