轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾PLGA納米粒的制備及其對(duì)黑色素瘤的靶向性研究

李宗祥，孫平

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾PLGA納米粒的制備及其對(duì)黑色素瘤的靶向性研究

李宗祥，孫平Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

目的構(gòu)建轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）與RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）共修飾PLGA（聚乳酸羥基乙酸，poly（lactic-co-glycolic acid）納米粒（TF／RGD-NPs），研究其黑色素瘤靶向性。方法采用乳化法制備TF和RGD共修飾納米粒（TF／RGD-NPs），考察其形態(tài)、粒徑、電位等理化性質(zhì)。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和黑色素瘤腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)考察TF／RGD-NPs與黑色素瘤B16細(xì)胞的親和力和腫瘤組織穿透能力。結(jié)果制備的TF／RGD-NPs粒徑為（113.4±12.5）nm，電位為（4.53±2.15）mV。體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明B16細(xì)胞對(duì)TF／RGD-NPs的攝取效率分別是TF-NPs和RGD-NPs的2.7倍和2.9倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和腫瘤球攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TF／RGD-NPs具有良好的黑色素瘤細(xì)胞親和力。結(jié)論轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾納米粒具有良好的黑色素瘤靶向性，是一種潛在的黑色素瘤靶向給藥系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白；RGD；PLGA納米粒；黑色素瘤；藥物靶向

1 材料與方法

1.1 材料 SizerNano ZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）。RGD peptide（上海強(qiáng)耀生物公司）；PLGA（聚乳酸羥基乙酸，山東省醫(yī)療器械研究所）；PLGA-PEG2000（美國Avanti polar lipids公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國 corning公司）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（美國 sigma公司）；PLGA-PEG2000-MAL（美國sigma公司）；其余試劑為分析純。鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16，ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 PLGA-PEG2000-TF和PLGA-PEG2000-RGD的合成：將適量轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）和Traut's reagent置于小反應(yīng)瓶中，加PBS緩沖液lmL溶解，室溫，氬氣下，反應(yīng)3 h。反應(yīng)產(chǎn)物過凝膠脫鹽柱，得到TF-SH溶液。將TF-SH溶液緩慢滴加入PLGA-PEG2000-MAL溶液，室溫，氬氣下，反應(yīng)24 h后凍干得到PLGA-PEG2000-TF。

參照Torchilin等［8］方法合成PLGA-PEG2000-RGD。將一定量商品化PLGA-PEG2000-Mal用適量氯仿溶于茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑成膜，真空干燥過夜。加入適量PBS緩沖液（pH 7.4）水化，水浴超聲5min使形成均勻的PLGA-PEG-Mal膠束溶液。將RGD多肽溶液加入上述膠束溶液，N2保護(hù)下4℃攪拌反應(yīng)直至TLC薄層色譜（展開劑甲醇∶二氯甲烷＝1∶10）觀察到PLGA-PEG2000-Mal點(diǎn)基本消失。Sephadex-G50凝膠色譜柱分離PLGA-PEG2000-RGD和游離RGD，溶液后凍干，除去水液，氯仿溶解后過濾除去無機(jī)鹽，重復(fù)操作2次得PLGA-PEG2000-RGD，減壓抽去氯仿，得到產(chǎn)物。

1.2.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD共修飾納米粒的制備：取PLGAPEG2000-TF 9.55 mg，PLGA-PEG2000-RGD 5.45 mg和 PLGAPEG2000-OMe 5.25mg，共同溶于2mL丙酮，室溫下緩慢滴加入不斷攪拌中的5mL水中，攪拌2 h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液中的有機(jī)溶劑，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD共修飾的PLGA納米粒。

1.2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞以5×105個(gè)／孔的密度接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h，分成 NPs組、TF-NPs組、RGD-NPs組和 TF／RGD-NPs組，每組分別加入適量相應(yīng)載香豆素-6的納米粒溶液，孔中香豆素-6的濃度為20 ng／mL。37℃分別孵育2、4 h后除去含納米粒培養(yǎng)基，冷PBS清洗3次，0.25%胰酶消化后離心，再用PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光值。另取相同組別納米粒與細(xì)胞共同孵育4 h，PBS漂洗3次，加入2μg／mLDAPI溶液，室溫孵育15min，再加冰PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取情況。

1.2.4 腫瘤球穿透性實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞，0.125%胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來后離心，棄去上清液。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于用低熔點(diǎn)瓊脂糖預(yù)處理的96孔板，將96孔板移入37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。7 d后成長為腫瘤球。按照“1.2.3”項(xiàng)下分組并給藥，置激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤球的熒光分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾PLGA納米粒的表征 將TF／RGD-NPs用磷鎢酸染色，透射電鏡（TEM）下觀察納米粒形態(tài)：制備的納米粒成球狀，形態(tài)均一（見圖1）。另取適量樣品用粒度儀測定其粒徑以及電位，測得納米粒的粒徑均＜200 nm，PDI＜0.3（見表1）。

圖1 轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾納米粒的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscopy image of TF／RGD-NPs

表1 不同納米粒的表征Tab.1 Characteristics of TF／RGD-NPs，RGD-NPs，TF-NPs and NPs

2.2 B16細(xì)胞對(duì)TF／RGD-NPs的攝取情況 定量體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明：給藥4 h后，B16細(xì)胞對(duì)TF／RGD-NPs的攝取效率分別是TF-NPs、RGD-NPs和NPs的2.7倍、2.9倍和4.3倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表2）。定性細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TF／RGD-NPs組的綠色熒光集中在被藍(lán)色DAPI染色的細(xì)胞核周圍，明顯強(qiáng)于其他組（見表2）。與定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 B16細(xì)胞對(duì)不同納米粒的攝取效率Tab.2 Uptake of different nanoparticles by B16 cells

圖2 激光共聚焦觀察B16細(xì)胞對(duì)載香豆素-6不同納米粒的攝取情況（×200）Fig.2 Uptake of coumarin-6 loaded different nanoparticles by B16 cells based on confocal laser scanningmicroscopy（×200）

2.3 TF／RGD-NPs對(duì)B16細(xì)胞腫瘤球的穿透性 腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：載香豆素-6的不同納米粒與腫瘤球共孵育4 h后，TF／RGD-NPs組的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，TF-NPs和RGD-NPs次之，NPs最弱，與體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（見圖3）。

圖3 載香豆素-6納米粒對(duì)B16細(xì)胞腫瘤球的穿透性Fig.3 Uptake of coumarin-6loadednanoparticles by B16 tumor spheroids

3 討論

有研究證實(shí)，在黑色素瘤細(xì)胞表面存在高度表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及整合素受體［9-10］。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種小分子糖蛋白，它可與腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合并在其介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)鐵蛋白連接在脂質(zhì)體上以實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向治療腫瘤已被廣泛研究且取得了初步成效［10］。RGD能特異識(shí)別含αv亞基的整合素家族［11-12］，有研究證明具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RGD顯示出與整合素 αvβ3、αvβ5的高度親和力［13-15］。因此，本研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD一起連接到PLGA納米粒表面，考察修飾后的納米粒對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的靶向性。由于兩種特異性小分子的選擇性，既可以避免載藥后對(duì)正常細(xì)胞的損傷，也可以利用2種配體的協(xié)同作用介導(dǎo)納米粒高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示：B16細(xì)胞對(duì)TF／RGD-NPs的攝取效率分別是TF-NPs、RGD-NPs和NPs的2.7倍、2.9倍和4.3倍，說明轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾能夠起到協(xié)同作用，促進(jìn)納米粒被腫瘤細(xì)胞所攝取。腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：共修飾納米粒比轉(zhuǎn)鐵蛋白和整合素受體RGD單獨(dú)修飾的納米粒具有更好的腫瘤組織穿透性。

綜上所述，本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾納米粒（RGD／TF-NPs）具有良好的黑色素瘤細(xì)胞靶向性，是一種潛在的黑色素瘤靶向給藥系統(tǒng)。

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（編校：吳茜）

Preparation of transferrin and RGD co-modified PLGA nanoparticles and its targeting to melanoma

LIZong-xiang，SUN PingΔ

（Hospital of Central China Agricultural University，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo prepare transferrin and Arg-Gly-Asp polypeptide co-modified nanoparticles（TF／RGD-NPs）and evaluate its targeting efficiency tomelanoma.MethodsThe co-modified nanoparticleswere prepared by emulsion method and its appearance，particle size and Zeta potential were evaluated.The cellular uptake experiment and melanoma tumor spheroids penetration testwere used to evaluate the affinity and ability to penetrate tumor tissues of TF／RGD-NPs tomelanoma B16 cells.ResultsThe particle diameter of co-modified nanoparticleswas（113.4±12.5）nm and the Zeta potentialwas（4.53±2.15）mV.In vitro uptake testdemonstrated that the efficacy of cellular uptaken TF／RGD-NPsby B16 cellswere2.7 times and 2.9 times to TF-NPs and RGD-NPs，respectively，the differences were all significant（P＜0.05）.Tumor spheroid penetration test results showed that TF／RGD-NPs has good affinity to melanoma cells.ConclusionTF／RGD-NPs can target to melanoma B16 cell efficiency in vitro，itmay be serve as a potential drug delivery system for targetingmelanoma.

transferrin；RGD；PLGA nanoparticle；melanoma；drug targeting

R739.5

A

1005－1678（2014）04－0019－03

黑色素瘤是臨床上一種常見的皮膚惡性腫瘤，其惡性程度高，臨床預(yù)后差。盡管其發(fā)病率比較低，僅占全部惡性腫瘤的1%～3%，但是隨著全球環(huán)境狀況的惡化，惡性黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)［1］。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是一種在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面都普遍存在的受體，但在腫瘤細(xì)胞的表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)是正常細(xì)胞的4～5倍［2］。整合素（Integrins）是一類細(xì)胞黏附受體分子，在有核細(xì)胞表面均廣泛表達(dá)，其中整合素αvβ3在卵巢癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，因此整合素αvβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點(diǎn)［3-5］。已有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）的三肽序列能夠特異性地識(shí)別含αv亞基的整合素家族，具有高度親和力［6-7］。本研究以經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的高分子材料聚乳酸羥基乙酸［poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA］為基礎(chǔ)制備納米粒，將轉(zhuǎn)鐵蛋白和RGD連接到納米粒表面，對(duì)共修飾納米粒的理化性質(zhì)進(jìn)行體外評(píng)價(jià)并對(duì)其黑色素瘤的靶向性進(jìn)行研究。

國家自然科學(xué)基金（81171365）

李宗祥，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：乳腺癌的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：lizongxiang1975＠163.com；孫平，通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：2094252562＠qq.com。