多肽修飾載紫杉醇脂質(zhì)體靶向A549肺癌干細(xì)胞的研究

蔡華榮，江躍全

（重慶市腫瘤研究所，重慶 400030）

多肽修飾載紫杉醇脂質(zhì)體靶向A549肺癌干細(xì)胞的研究

蔡華榮，江躍全Δ

（重慶市腫瘤研究所，重慶 400030）

目的制備與肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133具有高度親和力的多肽修飾載紫杉醇脂質(zhì)體（CD133 specific-binding peptide conjugated paclitaxel loaded liposome，TLP-PTX），考察TLP-PTX與A549肺癌干細(xì)胞的結(jié)合能力及其對(duì)A549肺癌干細(xì)胞和肺癌干細(xì)胞移植瘤的抑制作用。方法采用薄膜分散法制備TLP-PTX，觀察其粒徑，電位及紫杉醇的包封率等理化性質(zhì)。采用細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)考察TLP-PTX與A549肺癌干細(xì)胞的親和力。通過MTT實(shí)驗(yàn)和肺癌干細(xì)胞腫瘤球抑制實(shí)驗(yàn)觀察TLP-PTX對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制效果。結(jié)果制備得到的TLP-PTX粒徑為（115.8±8.3）nm，紫杉醇的包封率為88.5%。經(jīng)過CD133特異性多肽修飾后能夠明顯增強(qiáng)肺癌干細(xì)胞和腫瘤球?qū)χ|(zhì)體的攝取能力，A549肺癌干細(xì)胞對(duì)TLP的攝取效率是LP的2.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLP-PTX對(duì)A549肺癌干細(xì)胞的毒性顯著強(qiáng)于LP-PTX和紫杉醇溶液（P＜0.05）；A549肺癌干細(xì)胞腫瘤球抑制實(shí)驗(yàn)表明TLP-PTX具有良好的抗腫瘤效果。結(jié)論TLP-PTX能夠特異識(shí)別A549肺癌干細(xì)胞表面的CD133，介導(dǎo)脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞，抑制肺癌干細(xì)胞增殖。TLP-PTX是一種有效的A549肺癌干細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

多肽修飾；紫杉醇；脂質(zhì)體；CD133；腫瘤干細(xì)胞

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人源性肺癌細(xì)胞（A549，ATCC）。Sizer Nano ZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國(guó)Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；DSPE-PEG2000（美國(guó) Avanti polar lipids公司）；香豆素-6（coumarin-6，美國(guó) sigma公司）；DSPE-PEG2000-MAL（美國(guó) sigma公司）；TR肽（序列TISWPPR，蘇州強(qiáng)耀生物科技公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)corning公司）；其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 A549肺癌干細(xì)胞培養(yǎng)：采用不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞，培養(yǎng)條件為：5%CO2，飽和濕度，溫度37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時(shí)，用2.5 mg／L胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照閆秀萍等［6］方法分離得到A549肺癌干細(xì)胞：在無(wú)血清條件下培養(yǎng)肺癌細(xì)胞，利用細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)球體形成，球體細(xì)胞通過檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，鑒定其腫瘤干細(xì)胞的特性。

1.2.2 TLP-PTX的制備及表征：參照Xiong X B等［7］方法合成DSPE-PEG2000-TR。精密稱取大豆磷脂18.58 mg，膽固醇1.36mg，DSPE-PEG20002.15mg，DSPE-PEG2000-TR 0.24mg，紫杉醇0.32mg，將以上材料溶于氯仿中，在茄形瓶中減壓蒸餾成膜，除去有機(jī)溶劑，置于真空干燥器中過夜，使其充分干燥，加入1mL PBS水化，探頭超聲得到TLP-PTX。采用相同的方法制備得到普通脂質(zhì)體和載香豆素-6脂質(zhì)體。取100μL脂質(zhì)體稀釋到100mL，用馬爾文激光粒度儀測(cè)定粒徑和電位。用冷凍高速離心機(jī)300 000 r／min離心30min后取上清液，用甲醇破壞脂質(zhì)體，HPLC法在227 nm檢測(cè)紫杉醇含量。

1.2.3 A549肺癌干細(xì)胞對(duì)TLP的攝取觀察：培養(yǎng)A549肺癌干細(xì)胞，接種于24孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入一定載香豆素-6脂質(zhì)體，混合均勻后于5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育1 h和2 h，隨后棄去培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗3次，加入1mL 1%triton-100裂解細(xì)胞，4℃避光裂解0.5 h以上。待裂解完全后，取各組樣品200μL在Ex＝465 nm，Em＝502 nm用熒光分光光度計(jì)測(cè)定的熒光強(qiáng)度。將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，將A549肺癌干細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2μg／mL DAPI溶液，室溫孵育20min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦熒光倒置顯微鏡定性觀察細(xì)胞攝取情況。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)考察TLP-PTX對(duì)A549肺癌干細(xì)胞的增殖抑制作用：培養(yǎng)A549肺癌干細(xì)胞，接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分別加入TLP-PTX、LP-PTX和PTX溶液。將孔板移入37℃CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48 h后取出，每孔加入20μL 5mg／mLMTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振搖15min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔的光密度值（OD）。

1.2.5 A549肺癌干細(xì)胞腫瘤球的構(gòu)建：培養(yǎng)A549肺癌干細(xì)胞接種于96孔板中，將96孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)。7 d后成長(zhǎng)為腫瘤球。為了觀察不同脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球的穿透能力，腫瘤球生長(zhǎng)7 d后，分別加入載香豆素-6的TLP和LP，37℃孵育4 h后，將腫瘤球用PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力。為了考察不同載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)的抑制效果，腫瘤球生長(zhǎng)7 d后，分別加入TLPPTX、LP-PTX、PTX溶液。以PBS為陰性對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)腫瘤球體積大小變化情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLP-PTX的表征 制備得到的TLP-PTX的粒徑在115 nm左右，粒徑分布系數(shù)PDI＜0.3，zeta電位為8.25mV左右，紫杉醇的包封率為88.5%（見表1）。

表1 脂質(zhì)體的表征Tab.1 Characteristics of liposomes

2.2 A549肺癌干細(xì)胞對(duì)TLP的攝取 A549肺癌干細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過多肽修飾后2 h脂質(zhì)體的入胞效率是普通脂質(zhì)體的2.6倍（P＜0.01）。激光共聚焦顯微鏡定性觀察結(jié)果如圖2所示，TLP組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于LP。這與定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖1 A549肺癌干細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取*P＜0.01，與 LP比較；＃P＜0.01，與1 h比較Fig.1 The uptake of different liposomes by A549 lung cancer cells*P＜0.01，compared with LP；＃P＜0.01，compared with 1 h

圖2 A549肺癌干細(xì)胞對(duì)coumarin-6標(biāo)記的LP和TLP的攝?。ā?00）Fig.2 Uptake of liposomes labeled with coumarin-6 by A549 lung cancer stem cells（×200）

2.3 TLP-PTX抑制A549肺癌干細(xì)胞的增殖 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，TLP-PTX對(duì)A549肺癌干細(xì)胞的增殖抑制能力顯著強(qiáng)于紫杉醇脂質(zhì)體和游離紫杉醇溶液（P＜0.01）。3組藥物均能抑制A549肺癌干細(xì)胞增殖，這說明A549肺癌干細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感。給藥48 h后，TLP-PTX組肺癌干細(xì)胞存活率下降到28%。

圖3 TLP-PTX對(duì)肺腫瘤干細(xì)胞增值的影響*P＜0.01，與TLP在24 h比較；＃P＜0.01，與PTX和LP-PTX比較Fig.3 The cell viability after 24 h and 48 h treatments with various drugs*P＜0.01，compared with TLP group at24 h；＃P＜0.01，compared with PTX and LP-PTX groups

2.4 TLP的腫瘤球穿透能力觀察以及TLP-PTX對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用 利用A549肺癌干細(xì)胞的快速增殖以及分化能力構(gòu)建腫瘤球模型，用于評(píng)價(jià)TLP對(duì)腫瘤球的穿透能力以及載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制能力。腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，TLP組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于LP組，LP組熒光主要存在于腫瘤球的表面，而TLP組熒光則分布在整個(gè)腫瘤球組織，說明TLP能夠有效的穿透致密的腫瘤組織進(jìn)入腫瘤內(nèi)部。

圖4 香豆素-6標(biāo)記脂質(zhì)體對(duì)A549肺癌干細(xì)胞腫瘤球的穿透實(shí)驗(yàn)（×200）Fig.4 The uptake of coumarin-6 labeled liposomes by A549 lung cancer stem cells spheroids（×200）.

脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，給藥7 d后，PBS組腫瘤球持續(xù)生長(zhǎng)，體積增大到原來(lái)的1.48倍，TLPPTX、LP-PTX和PTX均能抑制腫瘤球的生長(zhǎng)，與細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。LP-PTX使腫瘤球體積減小到原體積的79%，LP-PTX組腫瘤球體積大小基本不變，PTX溶液使腫瘤球體積減小到原體積的91%。

圖5 給藥7 d后腫瘤球體積變化Fig.5 The change ratio of tumor spheroid after 7 days

3 討論

近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究發(fā)展，越來(lái)越多的研究已經(jīng)表明在腫瘤組織中存在著數(shù)量稀少的一類癌細(xì)胞，在腫瘤形成過程中充當(dāng)干細(xì)胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潛能，雖然數(shù)量少，卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，由于其眾多性質(zhì)與干細(xì)胞相似，所以這些細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells，CSCs）［8-9］。隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞研究的深入，越來(lái)越多的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，其中CD133是被研究最廣泛的一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。有研究證實(shí)［10-12］，肺癌干細(xì)胞屬于CD133＋細(xì)胞亞群，此類腫瘤干細(xì)胞具有球體形成能力以及快速增殖分化能力。因此CD133成為肺癌治療研究的新靶點(diǎn)。序列為TISWPPR的TR肽是通過噬菌體展示技術(shù)得到的與CD133具有高度親和能力的短肽。田平閣等［7］已經(jīng)通過研究證實(shí)TR肽能夠與高度表達(dá)CD133的結(jié)腸癌干細(xì)胞具有高度親和性。本研究將TR肽連接到脂質(zhì)體的表面，以紫杉醇為模型藥物，考察TR肽修飾的脂質(zhì)體與A549肺癌干細(xì)胞的親和力以及載藥脂質(zhì)體對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制效果。

本研究采用薄膜分散法制備了與CD133特異性結(jié)合肽修飾載紫杉醇脂質(zhì)體，粒徑在115 nm左右，紫杉醇的包封率為88%。通過A549肺癌干細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的定量和定性攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TLP與高度表達(dá)CD133的肺腫瘤干細(xì)胞具有良好的結(jié)合能力，CD133能促進(jìn)肺癌干細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取并介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞。這說明TR肽與高度表達(dá)CD133的腫瘤干細(xì)胞具有較好的親和力。通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該脂質(zhì)體對(duì)腦腫瘤干細(xì)胞的抑制能力。腫瘤干細(xì)胞作為腫瘤生長(zhǎng)的源動(dòng)力，抑制腫瘤組織內(nèi)部的腫瘤干細(xì)胞將有助于從根本上抑制腫瘤組織的發(fā)展。在某些實(shí)體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此給藥系統(tǒng)很難進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部［13-15］。本研究構(gòu)建了腫瘤球模型旨在模擬脂質(zhì)體在體內(nèi)腫瘤組織的分布情況以及對(duì)實(shí)體瘤組織的抑制能力。結(jié)果顯示TLP-PTX具有很好的腫瘤球穿透能力和抑制能力。

綜上所述，本研究制備得到的CD133特異性多肽修飾載紫杉醇脂質(zhì)體能夠高效靶向抑制肺癌干細(xì)胞，是一種潛在的肺癌干細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。該給藥系統(tǒng)的體內(nèi)腫瘤靶向性和腫瘤抑制能力研究正在進(jìn)一步進(jìn)行中。

［1］ Sugawara S，Maemondo M，Tachihara M，et al.Randomized phase II trial of uracil／tegafur and cisplatin versus vinorelbine and cisplatinwith concurrent thoracic radiotherapy for locally advanced unresectable stage IIInon-small-cell lung cancer：NJLCG 0601［J］.Lung Cancer，2013，81（1）：91-96.

［2］ Liu C，Kelnar K，Liu B，et al.ThemicroRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44［J］.Nat Med，2011，17（2）：211-215.

［3］ Wu X，Chen H，Wang X.Can lung cancer stem cells be targeted for therapies？［J］.Cancer Treat Rev，2012，38（6）：580-588.

［4］ Eramo A，Lotti F，Sette G，et al.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population［J］.Cell Death Differ，2008，15（3）：504-514.

［5］ 田平閣.靶向腫瘤千細(xì)胞標(biāo)記CD133特異性結(jié)合肽的篩選和初步鑒定［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（5）：761-766.

［6］ 閆秀萍.人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離及鑒定［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：1153-1157.

［7］ Xiong XB，Huang Y，Lu W，et al.Enhanced intracellular uptake of sterically stabilized liposomal Doxorubicin in vitro resulting in improved antitumor activity in vivo［J］.Pharm Res，2005，22（6）：933-939.

［8］ Wicha MS，Liu S，Dontu G.Cancer stem cells：an old idea—a paradigm shift［J］.Cancer Res，2006，66（4）：1883-1890，1895-1896.

［9］ Mannelli G，Gallo O.Cancer stem cells hypothesis and stem cells in head and neck cancers［J］.Cancer Treat Rev 2012，38（5）：515-539.

［10］EramoA，Lotti F，Sette G，et al.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population［J］.Cell Death Differ，2007，15（3）：504-514.

［11］Gan CW，F(xiàn)eng SS.Transferrin-conjugated nanoparticles of Poly（lactide）-D-a-Tocopheryl polyethylene glycol succinate diblock copolymer for targeted drug delivery across the blood-brain barrier［J］.Biomaterials，2010，31（30）：7748-7757.

［12］Qin Y，Chen H，Yuan W，et al.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery［J］.Int JPharm，2011，419（1-2）：85-95.

［13］KuaiR，Yuan W，LiW，etal.Targeted delivery of cargoes into amurine solid tumor by a cell-penetrating peptide and cleavable poly（ethylene glycol）comodified liposomal delivery system via systemic administration［J］.Mol Pharm，2011，8（6）：2151-2161.

［14］Li J，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an L，et al.Targeting the brain with PEGPLGA nanoparticlesmodified with phage-displayed peptides［J］.Biomaterials，2011，32（21）：4943-4950.

［15］Zhan C，Gu B，Xie C，et al.Cyclic RGD conjugated poly（ethyleneglycol）-co-poly（lactic acid）micelle enhances paclitaxel antiglioblastoma effect［J］.JControl Release，2010，143（1）：136-142.

（編校：吳茜）

Study on the ability of specific-binding peptidemodified liposome loaded paclitaxel targeting A549 lung cancer stem cell

CAIHua-rong，JIANG Yue-quanΔ

（Chongqing Cancer Institute，Chongqing 400030，China）

ObjectiveTo prepare CD133 specific-binding peptide conjugated liposome loaded paclitaxel and evaluate the efficiency of cellular uptake and the ability of inhibiting A549 lung cancer stem cell.MethodsLiposomes were prepared by film-ultrasonic method.The partical size，zetapotential and entrapment efficiency of liposomeswere evaluated.Cellular uptake effciency of A549 lung cancer stem cell for liposomeswere explored.The anti-proliferation efficiency of TLP-PTX to A549 lung cancer stem cell was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of TLP-PTX to A549 lung cancer stem cell.ResultsThe particle diameter of TLP-PTX was（115.8±8.3）nm and the entrapment efficiency of PTX was88.5%.CD133 specific-binding peptide could enhance the efficiency of cellar uptake.The uptaken efficiency of TLP by A549 lung cancer stem cellwere 2.6 times higher than that of LP（P＜0.05）.The MTT Results showed that the toxicity of TLP-PTX on A549 lung cancer stem cell was significantly stronger than LP-PTX and paclitaxel solution（P＜0.05）.The tumor inhibition test results showed that TLP-PTX has good anti-tumor effect.ConclusionTLP-PTX can specifically recognize the surface marker CD133 of A549 lung cancer stem cell，facilitate liposomes into cells and inhibit A549 lung cancer stem cell proliferation.TLP-PTX is an effective drug delivery system targeting to A549 lung cancer stem cell.

peptidemodified；paclitaxel；liposomes；CD133；neoplastic stem cells

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0012－04

肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首［1］。近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率呈急劇上升趨勢(shì)。手術(shù)和放化療是當(dāng)前肺癌治療的主要手段，然而由于肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使得肺癌的療效止步不前?，F(xiàn)在研究已經(jīng)證實(shí)多種實(shí)體腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，包括乳腺癌、胰腺癌、頭頸瘤、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌［2］以及肺癌［3］等。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是由于腫瘤干細(xì)胞具有耐藥和耐輻射的特性以及腫瘤干細(xì)胞高度的分化能力和致瘤能力［3］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，肺癌干細(xì)胞表面有大量CD133表達(dá)［4］。有研究表明［4］，A549肺癌干細(xì)胞表面大量表達(dá) CD133，TR肽是一種與 CD133高度親和的短肽［5］。因此本研究旨在將與CD133具有高度親和力的多肽連接到脂質(zhì)體表面，研究其靶向A549肺癌干細(xì)胞的作用，以期實(shí)現(xiàn)肺癌干細(xì)胞的靶向治療。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30970843）

蔡華榮，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤干細(xì)胞的靶向研究，E-mail：caihuarong1977＠163.com；江躍全，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤干細(xì)胞的靶向研究。