誘導(dǎo)食用真菌代謝生產(chǎn)木聚糖酶的研究

邢振楠，臧海蓮，王丹麗，范冬茹

(1.伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

木聚糖酶(xylanase)是一類能夠破壞植物纖維組織，降解半纖維素，主要成分為木聚糖的一組酶的總稱，屬于水解酶、胞外酶類，具有可誘導(dǎo)性。木聚糖酶已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，動(dòng)物飼喂，食品加工，能源開發(fā)，環(huán)境治理，造紙業(yè)以及功能性低聚糖制備等領(lǐng)域[1-4]，同時(shí)，還可為食用菌品種選育及分類提供重要參考[5]。木聚糖酶產(chǎn)生菌主要來源于自然菌株篩選，或通過誘變、基因工程、蛋白質(zhì)工程等分子技術(shù)改造產(chǎn)酶基因改變及提高菌體木聚糖酶分泌量。目前國內(nèi)外的研究主要集中在利用工程化菌株生產(chǎn)木聚糖酶，研究最多的是青霉、木霉、黑曲霉、鏈霉菌、酵母菌[6-9]等。利用大型食用真菌液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶鮮有報(bào)道。本研究以不同種木聚糖結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)液體發(fā)酵培養(yǎng)食用菌菌絲，從66株不同種的大型食用真菌中篩選產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化以確定最佳產(chǎn)木聚糖酶條件，同時(shí)，對(duì)液體發(fā)酵食用菌菌絲的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，為木聚糖酶生產(chǎn)及食用菌菌絲深加工提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌種及藥品

66個(gè)種(11株靈芝、9株木耳，18株香菇，及28株其他大型真菌)的食用真菌菌絲體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，菌種來自全國不同地域的多家科研機(jī)構(gòu)，部分野生品種采自黑龍江省伊春市小興安嶺地區(qū)。本實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純化學(xué)品。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式

誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(g/L)：木聚糖類似物，蛋白胨2.0 g, 酵母膏2.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g , K2HPO41.0 g , KH2PO40.46 g。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ(g/L)：馬鈴薯200.0 g煮沸30min浸出液，木聚糖類似物。

其中木聚糖類似物：可溶性淀粉、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、木聚糖、葡萄糖、木糖、微晶纖維素，添加濃度按實(shí)驗(yàn)組別要求。

3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑：將6.3 g DNS和262.0 mL 2M NaOH溶液，加到500.0 mL含有185.0 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5.0 g結(jié)晶酚和5.0 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液(pH5)：0.2 mol/L Na2HPO410.3 mL，0.1 mol/L檸檬酸 9.7 mL。

1.3 菌株培養(yǎng)及木聚糖酶活力測(cè)定

1.3.1 食用真菌菌絲產(chǎn)木聚糖酶誘導(dǎo)培養(yǎng)

2種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基與7種誘導(dǎo)底物的不同濃度交叉組合，150 r/min、25℃恒溫液體搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)基pH值根據(jù)實(shí)驗(yàn)組要求設(shè)定，測(cè)算66種大型食用真菌菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)后產(chǎn)木聚糖酶的酶活，比較產(chǎn)酶能力。

1.3.2 木聚糖酶活力定義

1 mL酶液在溫度為50℃，pH值5.0條件下，1min水解木聚糖生成1μmol木糖還原物質(zhì)的量為1個(gè)酶活力單位，以IU/mL表示。

1.3.3 超薄層瓊脂板擴(kuò)散法快速檢測(cè)法[10-11]

配制含0.1%木聚糖-檸檬酸磷酸二氫鈉瓊脂膠板，待膠板冷凝后在其上打出若干個(gè)直徑為0.7 cm的孔穴，用微量注射器向孔穴內(nèi)適量加入粗酶液，3重復(fù)。加入酶液的瓊脂薄板置50℃條件下，緩沖液保濕反應(yīng)3 h。取出薄板，用0.1%剛果紅液染色30 min后，lM NaC1溶被中漂洗2次，每次5min，此時(shí)顯現(xiàn)透明圈，再放入5%乙酸中至底物變?yōu)樽仙?，游?biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑，比較木聚糖酶的活性大小。

1.3.4 DNS法[12-13]

取4支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，編號(hào)后各加入2 mL 1%木聚糖溶液，并向1號(hào)試管中加入5 mL DNS溶液以鈍化酶活性，將4支試管同時(shí)在50℃水浴中預(yù)熱10 min，再各加入酶液1 mL， 2號(hào)試管中加入等體積的蒸餾水替代酶液，50℃ 水浴中保溫3 h后取出，立即向2、3、4號(hào)試管中各加入5 mL DNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。以1號(hào)試管溶液為空白對(duì)照調(diào)零點(diǎn)，在540 nm波長下測(cè)定2、3、4號(hào)試管液的OD值。

1.4 不同環(huán)境因素對(duì)誘導(dǎo)食用真菌提高木聚糖酶產(chǎn)量的影響

根據(jù)不同菌種利用誘導(dǎo)底物的能力添加木聚糖類似物研究不同底物濃度對(duì)真菌菌絲產(chǎn)木聚糖酶能力的影響，分別以0.1%、0.25%、0.5%、1%的梯度差添加誘導(dǎo)底物作為濃度試驗(yàn)組，以不添加誘導(dǎo)底物培養(yǎng)基培養(yǎng)作對(duì)照；分別以pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0作為酸堿度試驗(yàn)組，以pH值7.0作對(duì)照；分別以15、20、25、30、35 d作為培養(yǎng)天數(shù)試驗(yàn)組。以上各試驗(yàn)組分別以誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ?yàn)榕囵B(yǎng)液, 等量接種，按照1.3.1操作，設(shè)置對(duì)照組，按照1.3.3及1.3.4定時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)木聚糖酶能力。

1.5 誘導(dǎo)食用真菌產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化

參考1.4單因素對(duì)食用真菌菌株產(chǎn)酶的影響結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，選用L9(33)正交表，擬定的正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.6 食用真菌菌絲胞內(nèi)多糖提取

將50℃烘至恒重的食用菌菌絲體加入30倍蒸餾水，800 W微波處理10 min，過濾沉淀，取上清，加入95%乙醇，至乙醇終濃度為75%～80%，-4℃醇沉過夜。4000 r/min離心10 min沉淀食用菌粗多糖，30∶1水稀釋沉淀，按照體積比3∶1加入sevag試劑(氯仿∶異戊醇=24∶1) ，渦旋震蕩充分混勻，4000 r/min離心15 min去除蛋白及雜質(zhì)，重復(fù)以上步驟，至蛋白質(zhì)完全去除，取上清，3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，4000 r/min離心15min后，沉淀物60℃烘干，所得即為食用菌多糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶高產(chǎn)食用真菌菌種篩選

經(jīng)初篩和復(fù)篩后可最終確定黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236三株食用真菌菌絲體在不同培養(yǎng)條件以木聚糖為誘導(dǎo)物，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ液體發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后產(chǎn)木聚糖酶和多糖的能力相對(duì)較強(qiáng)，針對(duì)這3株菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)篩選確定的可誘導(dǎo)高產(chǎn)木聚糖酶的黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236均為伊春林科院保藏菌種。

2.2 單因素影響試驗(yàn)結(jié)果

圖1 木聚糖酶作用木糖酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測(cè)方法可行，酶活力可用OD540數(shù)值反應(yīng)，檢測(cè)木聚糖酶最小濃度為0.0001 g/mL，即可檢測(cè)0.069 IU/mL活力的木聚糖酶。并且，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，底物濃度一定，酶濃度高于一定值時(shí)DNS檢測(cè)值不再變化。

A

B

C

由圖2可知，不同菌種產(chǎn)木聚糖酶的能力受環(huán)境因素影響較大。其中，以木聚糖為誘導(dǎo)底物，當(dāng)每100mL培養(yǎng)基中加入0.75g木聚糖誘導(dǎo)不同菌種生產(chǎn)木聚糖酶均可獲得較好的酶活，即酶產(chǎn)量最高。由圖2B可知，培養(yǎng)液pH值對(duì)菌種產(chǎn)木聚糖酶影響較大，并且，不同菌種對(duì)培養(yǎng)液pH值要求不同，黑木耳LK8和玉田平菇在pH =7.0時(shí)，菌種產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，黑木耳LK8對(duì)培養(yǎng)基的要求中性偏堿性(OD540=2.43)，而玉田平菇則要求偏酸性(OD540=2.40)，香菇236在pH =5.0時(shí)，菌種產(chǎn)酶能力最強(qiáng)(OD540=2.12)，酸性條件下誘導(dǎo)該菌種產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)。通過由圖2C可知，經(jīng)20～35d液體誘導(dǎo)培養(yǎng)3株菌均可產(chǎn)生較高活性的木聚糖酶，產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，其中，黑木耳LK8誘導(dǎo)培養(yǎng)25d產(chǎn)酶效果最佳(OD540=2.0067)，誘導(dǎo)培養(yǎng)30d玉田平菇和香菇236的產(chǎn)酶能力較高(OD540分別為2.1091，1.9851)。

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

直觀分析結(jié)果見表2，由各因素均值分析可知：黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶酶活最高的最佳條件組合分別為A1B3C3，A2B3C3，A2B2C2，即最佳培養(yǎng)時(shí)間、pH值和底物木聚糖濃度(g/100mL)分別為20 d、7.5和1.0g/100mL；25 d、7.0和1.0 g/100mL；25 d、5.0和0.75 g/100mL。最佳條件組合時(shí)的酶活分別為：600.6IU/mL，672.5 IU/mL，345 IU/mL。由極差數(shù)據(jù)分析可知，黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導(dǎo)培養(yǎng)受各因素影響大小順序分別為：誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH>底物濃度>誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH >誘導(dǎo)時(shí)間>底物濃度，誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH >誘導(dǎo)時(shí)間>底物濃度，可見，本實(shí)驗(yàn)篩選出的3株經(jīng)木聚糖誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶活性較高的食用真菌誘導(dǎo)過程中誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH值是影響誘導(dǎo)效果的主要因素。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

2.4 食用菌多糖產(chǎn)量

圖3 菌絲多糖產(chǎn)量圖

15 d相同培養(yǎng)條件下，每100 mL黑木耳LK8、玉田平菇及香菇236液體培養(yǎng)菌絲體產(chǎn)精多糖量分別為0.0278 g， 0.0121 g，0.0025 g，菌絲多糖產(chǎn)率如圖3所示。

3 討論

木聚糖(xylan)是植物半纖維素的主要成份，是除纖維素之外自然界中最為豐富的多糖，也是自然界中最為豐富的可再生資源之一。水解酶系中各種酶相互之間協(xié)同完成，其中木聚糖酶是最關(guān)鍵的，然而，由于木聚糖復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性，很大一部分木聚糖未得到有效利用，造成巨大的資源浪費(fèi)。木聚糖酶是自然界中專性降解木聚糖的水解酶系，經(jīng)過木聚糖酶的系內(nèi)各種酶相互之間協(xié)同作用，木聚糖可完全被降解為小分子而參與自然生態(tài)循環(huán)。根據(jù)木聚糖酶的這一特性，生產(chǎn)木聚糖酶劑參與工業(yè)生產(chǎn)是可以低能耗高效率地利用木聚糖的最佳方式，因此，隨著應(yīng)用領(lǐng)域的增多，如何提高產(chǎn)量、降低成本，獲得適應(yīng)性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣的木聚糖酶成為研究者們主要研究方向。

由微生物代謝生產(chǎn)的木聚糖酶根據(jù)理化性質(zhì)的不同可分為酸性、中性、堿性木聚糖酶；根據(jù)作用底物的特異性，又可將木聚糖酶分為特異性和非特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中食用菌菌絲體對(duì)培養(yǎng)基酸堿度要求差別很大，后續(xù)將就食用菌代謝生產(chǎn)的木聚糖的理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，確定其理化性質(zhì)及應(yīng)用范圍，為木聚糖酶的使用應(yīng)用積累數(shù)據(jù)。并且，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌絲生長前期產(chǎn)多糖比率較高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長多糖比率有所下降，產(chǎn)酶能力則是隨菌絲代謝時(shí)間延長而增加，平衡產(chǎn)酶和產(chǎn)多糖時(shí)間點(diǎn)，是后續(xù)的主要研究內(nèi)容。

食用菌做為主要的木腐性、草腐性真菌，通過分泌具有專性和高活性的纖維素酶和木聚糖酶系分解培養(yǎng)基質(zhì)中的纖維素及半纖維素再加以吸收利用。另一方面，木聚糖酶屬胞外酶，具有可誘導(dǎo)性[14-16]，有研究表明，木聚糖及木聚糖類似物具有誘導(dǎo)木聚糖酶合成的功能[17-18]，可增加該酶代謝量，因此，開發(fā)研究利用食用菌代謝生產(chǎn)具有高活性的木聚糖酶是具有理論依據(jù)和可行性。并且，食用菌種類眾多，液體發(fā)酵技術(shù)成熟，食用菌多糖等附加值產(chǎn)值高，所以，探究大型食用真菌的深層價(jià)值，利用其生產(chǎn)木聚糖酶及其它酶系將成為未來科研的一個(gè)主要方向。

4 結(jié)論

4.1 以木聚糖為誘導(dǎo)底物，對(duì)66株大型食用真菌進(jìn)行液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選獲得3株產(chǎn)木聚糖酶較高的菌株，分別為黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236。

4.2 單因素結(jié)合正交試驗(yàn)可確定黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶酶活最高的最佳條件組合培養(yǎng)時(shí)間、pH值和底物木聚糖濃度(g/100mL)分別為20d、7.5和1.0g/100mL；25 d、7.0和1.0 g/100mL；25 d、5.0和0.75 g/100mL。

4.3 最佳條件組合時(shí)的酶活分別為：600.6IU/ mL，672.5 IU/ mL，345 IU/ mL，培養(yǎng)液pH值是影響誘導(dǎo)效果的主要因素。

[1] Beg QK, Bhushan B, Kapoor M, Hoondal GS.Enhanced production of a thermostable xylanase from Streptomyces sp.QG-11-3 and its application in biobleaching of eucalyptus kraft pulp[J].Enzyme and Microbial Technology, 2000,27(7): 459-466.

[2] Mathlouthi N, Mohamed MA, Larbier M.Effect of enzyme preparation containing xylanase and β-glucanase on performance of laying hens fed wheat/barley- or maize/soybean meal-based diets[J].British Poultry Science, 2003,44(1): 60-66.

[3] Moure A, Gullón P, Domínguez H, Parajó JC.Advances in the manufacture, purification and applications of xylo-oligosaccharides as food additives and nutraceuticals[J].Process Biochemistry, 2006,41(9): 1913-1923.

[4] Dutron A, Georis J, Genot B, Dauvrin T, Collins T, Hoyoux A, Feller G.Use of family 8 enzymes with xylanolytic activity in baking.World Intellectual Property Organization.2004.

[5] 韓增華, 張丕奇, 孔祥輝, 等.黑木耳胞外酶活變化與栽培性狀比較的研究[J].食用菌學(xué)報(bào), 2007, 14(4)：41-46.

[6] Malabadi RB, Raghvendra S, Kumar SV.Production of cellulose-free xylanase from a novel yeast used for biobleaching in paper industry[J].Research Journal of Microbiology, 2007,2(1): 24- 33.

[7] Gigi C, Adina C, Gabriela E.Optimization of biosynthesis conditions and catalytic behavior evaluation of cellulose-free xylanase produced by a new Streptomyces sp.Strain[J].AUDJC-Food Technology, 2011,36(1): 34-44.

[8] 于俊杰, 赫榮琳, 武改紅, 等.復(fù)合木質(zhì)纖維素酶菌株篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào), 2013(4): 101-109.

[9] 李里特, 丁長河, 江正強(qiáng), 等.一株產(chǎn)木聚糖酶鏈霉菌的鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶[J].微生物學(xué)通報(bào), 2003,30(6): 59-64.

[10] 郭清吉.木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及宏基因組文庫的構(gòu)建與篩選[D].青島科技大學(xué), 2008.

[11] 王宜磊, 鄧振旭.透明圈法快速篩選半纖維素分解菌[J].生物技術(shù), 2000.10(1): 37-39.

[12] 沈誠, 李戎, 胡婷莉, 等.木聚糖酶活力的二硝基水楊酸(DNS)測(cè)定法[J].印染, 2011(2): 35-39.

[13] Bailey MJ, Biely P, Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase acticity[J].J Biotechnol, 1992,23(5): 257-270.

[14] 韓曉芳, 鄭連爽.產(chǎn)木聚糖酶嗜堿細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備, 2002,3(11):25-27.

[15] 劉超綱, 勇強(qiáng), 余世袁.纖維素和木聚糖復(fù)合誘導(dǎo)合成木聚糖酶的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2001,21(1): 69-73.

[16] Pallavi D, Vivekanand V, Ganguly R.Parthenium sp.as a plant biomass for the production of alkalitolerant xylanase from mutant Penicillium oxalicum SAUE-3.510 in submerged fermentation[J].Biomass and Bioenergy, 2009,33(4): 581-588.

[17] Rajoka MI.Regulation of synthesis of endo-xylanase and β-xylosidase in Cellulomonas flavigena : a kinetic study[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005,21(4): 463-469.

[18] Oliverira LA, Porto Ana LF, Tambourgi EB.Production of xylanase and protease by Penicillium janthinellum CRC 87M-115 from different agricultural wastes[J].Bioresour Technol, 2006, 97(6): 862-867.