高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高，劉西哲，盧彥芳，趙曉娟，張志清*

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050051)

·論著·

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高1，劉西哲2，盧彥芳1，趙曉娟1，張志清1*

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050051)

目的建立測定艾瑞昔布片劑中艾瑞昔布的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass sepectrometry，LC-MS/MS)含量測定方法。方法樣品經(jīng)甲醇-水(80∶20,V/V)提取，0.22μm微孔濾膜濾過后采用LC-MS/MS法測定其中艾瑞昔布的含量。色譜柱為Waters Symmetry R C18(3.5μm,2.1mm×100mm)，流動相為乙腈-水，梯度洗脫；離子源為電噴霧離子化源(ESI源)，離子源溫度為550 ℃，以多反應監(jiān)測方式分別監(jiān)測離子對m/z 370.2～278.2(艾瑞昔布)和m/z 346.1～198.0(內(nèi)標奧美拉唑)。結(jié)果艾瑞昔布的監(jiān)測濃度在31.83～509.34μg/L范圍內(nèi)與內(nèi)標的峰面積比值呈良好線性關(guān)系(r=0.997 6)；平均加樣回收率在95.6%～103.4%范圍內(nèi)，相對標準差均小于6.1%(n=9)。結(jié)論該方法快速、靈敏，結(jié)果準確，適用于艾瑞昔布片劑的質(zhì)量控制。

色譜法，高壓液相；串聯(lián)質(zhì)譜法；艾瑞昔布

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.001

艾瑞昔布(imrecoxib)為環(huán)氧化酶2(cyclooxygehase-2,COX-2)選擇性抑制劑，于2011年5月獲國家食品藥品監(jiān)督管理局批準上市[1-2]。研究結(jié)果[3-7]表明，該藥通過抑制COX-2mRNA的表達而發(fā)揮其抗炎作用，對于急性和慢性炎癥具有潛在的治療作用，同時具有較高的安全性。艾瑞昔布為新化合物，化學名稱為1-正丙基-3-(4-甲基苯基)-4-(4-甲磺?；交?-2,5-二氫-1H-2-吡咯酮。已有文獻[8-9]報道使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography-masssepectrometry，LC-MS/MS)法測定生物樣品中艾瑞昔布及其代謝物的含量，制劑含量測定及質(zhì)量控制方法則未見報道。本實驗首次建立了靈敏、簡便、快速的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]用于該制劑的分析檢測和質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

API4000+型液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst1.6.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(ABSCIEX公司)；ProminenceCBM-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣和柱溫箱(日本島津公司)；CPA225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

艾瑞昔布對照品(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號66311003，純度為99.6%)；奧美拉唑(魯南制藥有限公司，純度為99.7%)；艾瑞昔布片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.1g；批號，11102551、12070351、12100351)；乙腈為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1LC條件：色譜柱，WatersSymmetryRC18
(100mm×2.1mm，3.5μm)；柱溫，40℃;流動相，乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0min，30%A；0～3min，30%→95%A；3～4min，95%A；4min，30%A；4～7min，30%A)；流速0.4mL/min；進樣量2μL。

2.1.2MS條件：離子源，電噴霧離子化源(ESI源)；監(jiān)測方式，正離子監(jiān)測；離子源噴射電壓5 500V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力10psi；碰撞氣壓力4psi；掃描方式，多反應監(jiān)測；用于定量分析的離子反應分別為m/z370.2～278.2 (艾瑞昔布)和m/z346.1～198.0(奧美拉唑)，掃描時間100ms。

2.2 溶液的制備與測定方法

2.2.1 供試品溶液的制備：取艾瑞昔布片20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(0.5g)，置于250mL量瓶中，加水50mL，振搖，加甲醇適量，超聲提取15min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液0.25mL，置于250mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備：取艾瑞昔布對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，獲得濃度為305.6mg/L的對照品貯備液。取該貯備液適量，加甲醇進行系列稀釋，獲得濃度為1 019.67、509.34、254.67、127.33、63.67μg/L的一系列標準溶液。

2.2.3 空白溶液的制備：按處方比例稱取一定量的不含艾瑞昔布的空白輔料，按照“2.2.1”項下方法制備空白溶液。

2.2.4 測定法：精密量取上述空白溶液、系列標準溶液和供試品溶液各0.5mL，分別精密加入濃度為84.7μg/L的奧美拉唑溶液0.5mL，搖勻。取2μL進樣測定，記錄艾瑞昔布和奧美拉唑的色譜峰峰面積。

2.3 結(jié)果

2.3.1MS條件的選擇：取200μg/L的艾瑞昔布標準溶液，以10μL/min的速度注入MS/MS儀，分別在正負離子檢測模式下記錄艾瑞昔布的一級MS和二級MS圖。結(jié)果表明，艾瑞昔布具有較強的正離子信號，正離子比較穩(wěn)定，因此選擇正離子模式進行艾瑞昔布的定量檢測。分別選定艾瑞昔布和奧美拉唑的監(jiān)測離子對為m/z370.2～278.2和m/z346.1～198.0。隨后進行系統(tǒng)優(yōu)化，確定了MS檢測的最佳參數(shù)，包括源噴射電壓(5 500V)、源溫度(550℃)、氣簾氣壓力(10psi)、碰攔氣壓力(4psi)、CE(艾瑞昔布31eV，奧美拉唑14eV)、DP(艾瑞昔布120V，奧美拉唑52V)。

2.3.2 干擾試驗：取空白溶液、艾瑞昔布標準溶液和供試品溶液各適量，按照“2.2.4”項下方法采用LC-MS/MS法進行分析，記錄色譜圖。艾瑞昔布和奧美拉唑的保留時間分別為3.92min和2.63min，空白溶液中未見干擾峰，表明共存組分不會影響艾瑞昔布的定量檢測。

2.3.3 線性關(guān)系考察：取艾瑞昔布系列標準溶液適量，按“2.2.4”項下方法測定，記錄色譜圖。以艾瑞昔布的檢測濃度(X)為橫坐標，艾瑞昔布和奧美拉唑的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸分析，計算得回歸方程為Y=0.002 65X+0.040 8(r=0.997 6，n=5)。結(jié)果表明，艾瑞昔布的檢測濃度在31.83～509.34mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 檢測限(limitofdetection,LOD)和定量限(limitofquantity,LOQ)：取艾瑞昔布對照品溶液稀釋若干倍，按照“2.2.4”項下方法進樣分析，根據(jù)S/N≥3∶1，測得艾瑞昔布的LOD為0.5mg/L；根據(jù)S/N≥10∶1，測得艾瑞昔布的LOQ為1.5mg/L。

2.3.5 精密度試驗：取濃度為254.67mg/L的對照品貯備液，按照“2.2.4”項下方法進樣分析，重復進樣6次。結(jié)果，RSD=1.4%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.6 重復性試驗：取適量樣品6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定。結(jié)果，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12h依法進樣測定。結(jié)果，RSD=1.1%(n=6)，表明艾瑞昔布在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗：取同批樣品細粉適量(相當于艾瑞昔布50mg)，共9份，分別置于50mL量瓶中，加入艾瑞昔布對照品適量，配制成低、中、高三個濃度，按照“2.2.3”項下方法操作，測定含量，計算加樣回收率，見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery tests (n=9)

RSD：relative standard deviation

2.3.9 樣品含量測定：取3個批次的艾瑞昔布片，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.4”項下色譜條件進行含量測定。3批樣品的含量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果Table 2 Results of content determination of samples (n=3)

RSD：relative standard deviation

3 討 論

3.1 流動相的選擇：本實驗考察了流動相條件，甲醇-水、乙腈-水。發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇-水時，峰型不好，形成多重峰。無論是改變流動相比例，還是使用等度、梯度洗脫，狀況均未改善。流動相改為乙腈-水時，峰型有了較好的改觀。本實驗又進一步考察了不同組成和不同梯度的流動相對分析結(jié)果的影響，使得艾瑞昔布與內(nèi)標奧美拉唑的保留時間適中。結(jié)果表明艾瑞昔布與奧美拉唑可獲得良好地分離，未發(fā)現(xiàn)干擾成分，并且最終運行時間為7min，方法簡便、快速、準確。

3.2 內(nèi)標的穩(wěn)定性:奧美拉唑的結(jié)構(gòu)具有亞磺?；侨鯄A性化合物，在酸性溶液中容易降解，很快分解為砜化物和硫醚化物；同時，奧美拉唑溶液的穩(wěn)定性受溫度和光線的影響，應低溫、避光、現(xiàn)配現(xiàn)用。

本實驗通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件建立了LC-MS/MS法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量，經(jīng)過方法學確證，結(jié)果表明本法專屬性好、靈敏度高、線性關(guān)系良好，適用于艾瑞昔布片劑的質(zhì)量控制。

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CONTENTDETERMINATIONOFIMRECOXIBINIMRECOXIBTABLETSBYLC-MS/MS

LIFeigao1,LIUXizhe2,LUYanfang1,ZHAOXiaojuan1,ZHANGZhiqing1*

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveToestablishahighperformanceliquidchromatography-masssepectrometry(LC-MS/MS)methodforthedeterminationofimrecoxibinimrecoxibtablets.MethodsThesampleswerefirstlyextractedwithmethanol-watersolution(80∶20,V/V),andthenfilteredthrough0.22μmmicroporefilm.ThecontentofimrecoxibwasdeterminedbyLC-MS/MS.ThedeterminationwasperformedonWatersSymmetryRC18(3.5μm,2.1mm×100mm)columnwithgradientelution.Themassspectrometerwasoperatedinthepositiveionizationelectrospray(ESI)modeusingmultiplereactionmonitoringforanalysisofimrecoxibat550℃.Thetransitionsofm/z370.2-278.2(imrecoxib)andm/z346.1-198.0 (omeprazole)wereusedtoquantifyimrecoxibandomeprazole.ResultsThelinearrangeofimrecoxibwas31.83-509.34μg/L(r=0.997 6)andthemethodrecoverywaswithin95.6%-103.4% (RSD<6.1%,n=9).ConclusionThemethodisrapid,sensitiveandaccurate,anditissuitableforthequalitycontrolofimrecoxibtablets.

chromatography,highpressureliquid;tandemmassspectometry;imrecoxib

2013-05-20；

2013-08-28

李飛高(1985-)，男，河北邢臺人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥師，理學碩士，從事臨床藥學、藥物新制劑研究。

*通訊作者。E-mail：777yyy@sina.cn

R446.1

A

1007-3205(2014)03-0249-03

劉斯靜)