KB-R7943對心力衰竭家兔哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制作用

高亞男 趙雷 盧志耀 封啟龍 吳博威

基礎(chǔ)研究

KB-R7943對心力衰竭家兔哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制作用

高亞男 趙雷 盧志耀 封啟龍 吳博威

作者單位：030001 太原市，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室（高亞男、封啟龍、吳博威），基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（盧志耀）；武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（趙雷）

目的 探討鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響。方法40只成年家兔隨機分為5組：假手術(shù)組、心衰對照組、哇巴因組、哇巴因合并KB-R7943（1 μmol/L）組和哇巴因合并 KB-R7943（ 5 μmol/L）組。 心衰組、哇巴因組、哇巴因合并 KB-R7943（ 1 μmol/L）組和哇巴因合并 KBR7943（5 μmol/L）組使用主動脈瓣關(guān)閉不全聯(lián)合腹主動脈縮窄的方法建立心衰模型。建模8周后超聲檢測心功能，并利用Langendorff離體心臟灌流方法檢測家兔各項離體心功能指標。灌流哇巴因（5 μmol/L，4 ml）誘發(fā)家兔心衰心臟產(chǎn)生心律失常，觀察KB-R7943對離體心衰家兔心律失常的影響。結(jié)果 ①超聲結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心衰對照組家兔左室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（%FS）均明顯降低（P<0.05）。②離體條件下，心衰對照組家兔離體心臟左室發(fā)展壓（LVDP）、心率（HR）、室內(nèi)壓最大上升速率（＋dp/dtmax）、室內(nèi)壓最大下降速率（－dp/dtmax）較假手術(shù)組均明顯下降（P<0.05）。③哇巴因組1 h內(nèi)總心律失常（TT）、室速（VT）、室顫（VF）持續(xù)時間較心衰對照組明顯增加（P<0.05）。④與哇巴因組比較，哇巴因聯(lián)合應(yīng)用KB-R7943組 1 h 內(nèi) TT、VT 、VF 持續(xù)時間明顯減短（ P<0.05）；與 1 μmol/L KB-R7943 相比，5 μmol/L KB-R7943 可使哇巴因誘發(fā)TT和VT時間進一步縮短（P<0.05）。結(jié)論 鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943可抑制哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的持續(xù)時間，且較高濃度（5 μmol/L）KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的抑制作用更強。

鈉-鈣交換體； KB-R7943； 心力衰竭； 心律失常； 哇巴因

充血性心力衰竭簡稱心衰，指由于心室泵血或充盈功能低下，心排血量不能滿足機體代謝需要的一類綜合征，是多種心血管疾病終末期的表現(xiàn)，是21世紀心血管醫(yī)生面臨的兩大挑戰(zhàn)之一[1]。隨著年齡增長，心力衰竭的患病率顯著提高，已成為65歲以上患者住院的重要原因。洋地黃類藥物是臨床治療心衰的常用藥物，但是因其安全范圍很小，用量掌握不當很容易導(dǎo)致藥物中毒而誘發(fā)心律失常。許多研究表明，洋地黃中毒所致的心律失常與心肌細胞內(nèi)鈣超載密切相關(guān)。在心力衰竭時，反向模式的鈉-鈣交換體（NCX）的激活所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流是心肌細胞鈣超載的重要機制[2]。有文獻報道[3，4]，心肌NCX與心肌缺血-再灌注損傷期間發(fā)生的鈣超載及心律失常有關(guān)，抑制NCX可減輕缺血再灌注損傷及其誘發(fā)的心律失常。然而，抑制NCX能否減輕洋地黃類藥物所致心力衰竭心臟發(fā)生的心律失常，迄今鮮有報道。本研究在建立家兔心衰模型的基礎(chǔ)上，利用離體心臟灌流系統(tǒng)觀察NCX特異性阻斷劑KB-R7943對洋地黃藥物哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年家兔，體重（2.5±0.1）kg，雌雄不限（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。動物隨機分為5組：假手術(shù)組、心衰對照組、哇巴因組、哇巴因合并KB-R7943（1 μmol/L）組和哇巴因合并KB-R7943（5 μmol/L）組，每組 8 只。

1.2 藥品與試劑 KB-R7943、哇巴因（美國SIGMA公司），NaCl、NaH2PO4、MgCl2、CaCl2和KCl（BIO BASIC INC公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 實驗儀器 Vivid7 Rro超聲檢測儀（美國GE公司）、RM6240B生物信號采集處理系統(tǒng)2.0e和YPJ01型壓力換能器（成都醫(yī)療儀器廠）、HX200一動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）、Langendorff離體心臟灌流裝置（ADInstruments公司）、BQ50lJ蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）、85-2恒溫磁力攪拌器、pH計（上海精科公司）、電子天平（德國Sartorius BSA124S）。

1.4 主要溶液配制 臺氏液（mmol/L）：NaH2PO40.33、glucose 10、MgCl21.0、HEPES 5.0、NaCl 140、CaCl21.8、KCl 5.4，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38。哇巴因溶液（5 μmol/L）：生理鹽水 100 ml、哇巴因（364 μg）。KB-R7943 溶液（500 μmol/L）：生理鹽水 10 ml、KB-R7943（4.27 mg）。

1.5 心衰模型的制備[5]使用主動脈瓣關(guān)閉不全型合并腹主動脈縮窄方法建立心力衰竭模型。家兔稱重，3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg劑量麻醉，無菌條件下手術(shù)。暴露出右側(cè)頸動脈，將連接壓力換能器充滿肝素的4 F導(dǎo)管由右側(cè)頸總動脈切口插入左心室，用力快速捅穿瓣膜數(shù)次，當脈壓增加幅度＞50%時，表明主動脈瓣已有破損。2周后進行腹主動脈縮窄手術(shù)。將直徑2.42 mm的導(dǎo)管與腹主動脈平行放置，一起結(jié)扎后緩慢撤出導(dǎo)管，使腹主動脈直徑縮小一半。術(shù)后均注射青霉素3 d以防感染。

1.6 超聲心動圖檢測 用小動物專用超聲探頭，于造模后8周進行檢測。超聲測量以下指標：室間隔舒張期厚度（IVSd）、室間隔收縮期厚度（IVSs）、左室壁舒張期厚度（LVIDd）、左室壁收縮期厚度（LVIDs）、左室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）。

1.7 離體心臟灌流方法 家兔稱重，3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹腔注射肝素鈉1000 IU。開胸迅速取出心臟（主動脈預(yù)留1.5 cm用以插管）置于4℃臺式液中，修剪后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以100%氧氣飽和臺式液恒溫（37℃）、恒壓（7.35 kPa）灌流心臟。在左心耳下緣剪0.5 cm的切口，將連接壓力換能器的乳膠囊泡經(jīng)切口插入左心室，舒張壓調(diào)整在 0～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）范圍內(nèi)。灌流心臟30 min，各指標穩(wěn)定后進行實驗，觀測假手術(shù)組和心衰組LVDP、HR、±dp/dtmax。將心電圖正負極導(dǎo)線分別貼附于心臟右心耳下緣和心尖處，記錄心電圖。心衰組用正常臺式液灌流以作對照，哇巴因組灌流含5 μmol/L哇巴因的臺式液，哇巴因合并KB-R7943組在灌流含5 μmol/L哇巴因的臺式液前預(yù)先加灌 KB-R7943（1 μmol/L、5 μmol/L），記錄1 h內(nèi)各組心律失常的持續(xù)時間。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。結(jié)果以±s表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物心臟超聲檢查 與假手術(shù)組相比，心衰對照組家兔心臟 IVSd為（3.2±0.4）mm、IVSs（3.7±0.5）mm、LVIDd（21.8±2.1）mm、LVIDs（13.0±2.5）mm、LVPWd（3.5 ±0.4）mm、LVPWs（4.2 ±0.4）mm，均明顯增加（P<0.05）；EF（8.5±9.7）%、FS（23.0±5.3）%，明顯降低（P<0.05）。超聲結(jié)果顯示心力衰竭模型制備成功。見表1，圖1。

2.2 家兔離體心臟心功能檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，心衰組家兔離體心臟LVDP為（32.6±8.4）mm Hg、HR（70.7±15.4）次/min、＋dp/dtmax（353.0±30.9）mm Hg/s、－dp/dtmax（276.1±38.6）mm Hg/s，均明顯降低（P<0.05），提示心衰兔心室舒張和收縮功能均下降。見表2。

2.3 各組心律失常持續(xù)時間比較 心衰組離體心臟給予哇巴因（5 μmol/L、4 ml）后，在 1 h 內(nèi)總心律失常（TT）時間為（1427.3±77.3）s、室速（VT）時間（254.3±17.8）s、室顫（VF）時間（18.60±7.10）s，與心衰對照組相比均明顯增加（P<0.05）。哇巴因聯(lián)合應(yīng)用 KB-R7943（1 μmol/L） 組總心律失常時間（766.1±10.3）s、室速時間（167.2±11.9）s、室顫時間（6.80±2.90）s，與單獨使用哇巴因組相比均明顯縮短（P<0.05）。此外，與 1 μmol/L KB-R7943 組相比，5 μmol/L KB-R7943可使哇巴因誘發(fā)總心律失常、室速的持續(xù)時間進一步縮短，分別為（343.0±18.9）s和（44.1±18.5）s（P<0.05）。見表 3，圖 3。

表1 假手術(shù)組、心衰組家兔心臟超聲檢測結(jié)果（±s）

表1 假手術(shù)組、心衰組家兔心臟超聲檢測結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05

FS（%）假手術(shù)組 8 2.5±0.2 2.9±0.2 14.9±4.1 8.0±2.4 2.5±0.3 3.1±0.4 71.5±9.5 41.0±6.2心衰組 8 3.2±0.4a3.7±0.5a21.8±2.1a13.0±2.5a3.5±0.4a4.2±0.4a48.5±9.7a23.0±5.3a組別 例數(shù) IVSd（mm）IVSs（mm）LVIDd（mm）LVIDs（mm）LVPWd（mm）LVPWs（mm）EF（%）

表2 各組家兔離體心臟心功能檢測結(jié)果（±s）

表2 各組家兔離體心臟心功能檢測結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05

-dp/dtmax（mm Hg/s）假手術(shù)組 8 80.9±9.9 168.1±13.7 1234.3±156.6 880.0±84.0心衰組 8 32.6±8.4a70.7±15.4a353.0±30.9a276.1±38.6a組別 例數(shù) LVDP（mm Hg）HR（次/min）+dp/dtmax（mm Hg/s）

3 討論

圖1 假手術(shù)與心衰模型兔超聲心動圖

Na+/Ca2+交換體（NCX）是一種重要的雙向跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，具有正向（鈣外排）和反向（鈣內(nèi)流）兩種轉(zhuǎn)運模式[6]。NCX具有生電性，正向模式將3個Na+運入細胞伴隨著1個Ca2+排出細胞，產(chǎn)生內(nèi)向電流。當細胞內(nèi)鈣超載時，肌漿網(wǎng)釋放鈣離子增加,使細胞內(nèi)鈣離子濃度急劇增加[7]。由于細胞內(nèi)外鈣離子濃度的變化,大量激活正向型NCX，由此產(chǎn)生的瞬時內(nèi)向電流可導(dǎo)致遲后除極（DADS）和觸發(fā)性心律失常。在心肌細胞中，NCX對胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控起著很重要的作用。生理狀態(tài)下NCX活動是心肌細胞鈣外排的主要機制之一，以使胞內(nèi)Ca2+恢復(fù)至靜息水平。在病理狀態(tài)下，如缺血/再灌注、心力衰竭，通過反向NCX進入細胞內(nèi)鈣離子可觸發(fā)肌漿網(wǎng)釋放鈣離子，引起細胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致包括心律失常在內(nèi)的多種心肌病理改變[7,8]。

圖2 A 加入哇巴因（5 μmol/L、4 ml）后的心電圖B a.加藥前 b.早搏 c.室速 d.室顫

圖3 KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心衰家兔心律失常的影響

表3 各組家兔心律失常發(fā)生時間的比較（±s）

表3 各組家兔心律失常發(fā)生時間的比較（±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與哇巴因組相比，bP<0.05；與哇巴因+KBR7943（1 μmol/L）組比較，cP<0.05

組別 例數(shù) TT（s） VT（s） VF（s）心衰對照組 8 27.5±8.6 10.1±7.4 0.25±0.70哇巴因組（5 μmol/L、4 ml） 8 1427.3±77.3a254.3±17.8a18.60±7.10a哇巴因+KB-R7943（1 μmol/L） 8 766.1±10.3b167.2±11.9b6.80±2.90b哇巴因+KB-R7943（5 μmol/L） 8 343.0±18.9bc44.1±18.5bc3.10±1.80b

本研究表明，給予過量哇巴因后可誘發(fā)心衰心臟發(fā)生明顯的心律失常。關(guān)于哇巴因誘發(fā)心律失常的機制，目前認為，哇巴因通過抑制鈉-鉀泵，細胞內(nèi)Na+蓄積，引起依賴于鈉-鈣交換反向模式的細胞內(nèi)鈣超載。細胞內(nèi)鈣超載可促進肌漿網(wǎng)振蕩性鈣釋放而產(chǎn)生一種致心律失常的暫時性內(nèi)流（Transient inward current，ITI）。據(jù)報道，ITI的組成可能包括鈉-鈣交換電流、非選擇性陽離子流和鈣激活的氯電流[9,10]。本研究選取NCX為靶點，通過抑制其功能，觀察抑制NCX對洋地黃中毒性心律失常的影響。結(jié)果表明，給予鈉-鈣交換阻斷劑KBR7943后，由過量哇巴因誘發(fā)心衰兔的心律失常發(fā)生時間明顯降低，且加入5 μmol/L KB-R7943，心律失常發(fā)生時間要明顯少于KB-R7943（1 μmol/L）組。我們推測，這可能與過量哇巴因灌注引起細胞內(nèi)鈣超載后，KB-R7943使舒張期內(nèi)鈣減少，消除了隨后的鈣振蕩引起的心律失常有關(guān)[11,12]。

目前關(guān)于KB-R7943對洋地黃性心律失常影響的研究仍較少，且多用健康大鼠或豚鼠建立心律失常模型。Watano等[10]用正常豚鼠離體心臟為標本，通過研究發(fā)現(xiàn)，給予KB-R7943可對抗哇巴因所誘發(fā)的心律失常，并在進一步實驗中發(fā)現(xiàn)靜脈注射KB-R7943可抑制麻醉豚鼠哇巴因中毒所致的心律失常。Satoh等[13]證實，KB-R7943對大鼠心肌中的鈣超載也同樣有抑制作用。然而，一方面鼠與人種屬差異較大；另一方面，與正常心臟相比，心衰狀態(tài)下多種離子通道（如L-型鈣通道、鈉鈣交換體、鈉通道、瞬時外向鉀通道等）均發(fā)生結(jié)構(gòu)或（和）功能上的適應(yīng)性改變，這些改變在發(fā)揮代償功能的同時也將成為心衰時各種新的心律失常發(fā)生的誘因[14-16]。本實驗選用家兔為實驗動物，在建立心力衰竭模型的基礎(chǔ)上，觀察NCX阻斷劑KB-R7943對洋地黃性心律失常的影響。與以往研究相比，本研究不同之處在于，首先，本研究使用家兔作為實驗動物。與鼠類相比，兔與人種屬更接近，從而減小了實驗動物與人的種屬差異性。其次，本研究在建立心衰模型的基礎(chǔ)上，觀察了KB-R7943對哇巴因誘發(fā)心律失常的影響，這比對健康動物誘發(fā)心律失常更符合臨床客觀實際情況，因而也更具臨床實際意義。

綜上所述，鈉-鈣交換體阻斷劑KB-R7943可減輕心衰家兔離體心臟哇巴因誘發(fā)的心律失常，且較高濃度（5 μmol/L）KB-R7943 較低濃度（1 μmol/L）對心衰家兔哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制效應(yīng)更強。本研究為臨床使用洋地黃治療心衰時如何有效預(yù)防或減輕其中毒所致心律失常提供了實驗依據(jù)。

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The inhibitory effect of KB-R7943 on ouabain induced arrhythmia in rabbits with heart failure

GAO Ya-nan＊， ZHAO Lei， LU Zhi-yao， et al.＊Department of Physiology， Key Laboratory of Cellular Physiology of Shanxi Province and Ministry of Education，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the effect of KB-R7943， a potent inhibitor of the Na+/Ca2+exchanger， on ouabain-induced arrhythmia in heart failure in rabbits．Methods 40 adult rabbits were randomly divided into five groups：sham-operated（ sham， n=8）， heart failure in the control（ HF， n=8）， ouabain（ n=8）， ouabain plus KB-R7943（ 1 μmol/L， n=8） and oubain plus KB-R7943（ 5 μmol/L， n=8） groups.The heart failure models were established by aortic insufficiency combined with abdominal aorta constriction.Eight weeks after operation，cardiac function were detected using cardiac ultrasound and Langendorff-perfused system both in anaesthetized and in isolated rabbit hearts.Cardiac arrhythmias was induced with ouabain （ 5 μmol/L， 4 ml） and effects of KBR7943 at 1 μmol/L and 5 μmol/L， respectively on ouabain-induced arrhythmia were observed in failing hearts.Results ⑴Compared with the sham group，it was showed that the left ventricular ejection fraction（LVEF）and fractional shortening rate （%FS） in HF group were significantly reduced by ultrasound detection（P<0.05）.⑵Compared with sham group， left ventricular developed pressure（ LVDP）， heart rate（ HR）， the maximal rising rate of left ventricular pressure（ +dp/dtmax） and the maximal falling rate of left ventricular pressure（ -dp/dtmax） all decreased in Langendorff-perfused hearts in HF group （ P<0.05）. ⑶Duration of the total arrhythmias time（ TT），ventricular tachycardia（VT） and ventricular fibrillation（VF） in ouabain group increased significantly than in HF group（ P<0.05）.⑷Durations of TT， VT and VF decreased significantly in oubain plus KB-R7943 groups when compared with ouabain group （ P<0.05）.Compared with 1 μmol/L KB-R7943 group， TT， VT and VF durations were further reduced in 5 μmol/L KB-R7943 group.Conclusion Sodium-calcium exchanger inhibitor KB-R7943 reduces the durations of arrhythmia induced by ouabain in isolated failing hearts in rabbits， and the inhibitory effect of high concentrations（ 5 μmol/L） KB-R7943 is stronger.

Na+/Ca2+exchanger； KB-R7943； Heart failure； Arrhythmias； Ouabain

FENG Qi-long， E-mail：fengqilong@163.com

山西省優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人基金；山西省高?！?31”領(lǐng)軍人才工程項目基金

封啟龍，E-mail：fengqilong@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．05．016

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2014）05-0449－05

2014-01-29）