淋巴管密度與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

鄧 戀 劉陶文 屈元姣 曹軼林 陳 熙 彭麗芳

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是1種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，初診時(shí)發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者達(dá)75%以上[1-2]。淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)是評(píng)估腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)。已觀察到實(shí)體瘤瘤組織周圍淋巴管與瘤內(nèi)淋巴管的分布存在差異，尤其是瘤周淋巴管與腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)[3-4]。但是，關(guān)于鼻咽癌淋巴管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究較少，其臨床意義有待明確。本研究應(yīng)用淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性和敏感性標(biāo)記物單克隆抗體D2-40標(biāo)記鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中的淋巴管，以探討LVD與鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2011年10月至2012年10月，廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院腫瘤科收治的、并經(jīng)病理檢查確診為鼻咽癌患者66例，均為低分化鱗狀細(xì)胞癌，具有完整的相關(guān)臨床病理資料；患者均為初治且取組織標(biāo)本前未接受放化療；排除存在明顯炎癥、壞死及嚴(yán)重出血的組織標(biāo)本。其中男性51例，女性15例，中位年齡48.5歲(19～77歲)。按照我國(guó)鼻咽癌2008分期(福州2008分期)標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期6例，Ⅲ期26例，Ⅳa期27例，Ⅳb期6例，其中T1期2例，T2期11例，T3期31例，T4期22例；N0期11例，N1a期6例，N1b期12例，N2期22例，N3期15例；M0期60例，M1期6例。對(duì)照組：30例同期就診于該院，并經(jīng)病理檢查確診為輕度鼻咽黏膜炎的鼻咽組織，其中男性18例，女性12例，中位年齡49.5歲(16～78歲)。

1.2 試劑及方法

即用型免疫組化EliVisionTM super 試劑盒(鼠/兔)、商品化即用型D2-40鼠抗人單克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。石蠟標(biāo)本經(jīng)2 μm連續(xù)切片，采用免疫組化Elivison二步法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行染色。陰性對(duì)照組用PBS液代替一抗，以已知陽(yáng)性反應(yīng)片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

D2-40免疫組化染色以細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，LVD計(jì)數(shù)采用Weidner等[5]報(bào)道的方法，以D2-40染色陽(yáng)性的單層扁平上皮且管腔內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞聚集的脈管視為淋巴管，D2-40染色陽(yáng)性的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇同樣視為1個(gè)淋巴管。瘤周區(qū)域?yàn)榘┘?xì)胞團(tuán)塊周圍2 mm范圍以內(nèi)的組織區(qū)域。先在低倍鏡下(10×)分別找到瘤內(nèi)及瘤周區(qū)域陽(yáng)性脈管的集中區(qū)，即“熱點(diǎn)”，再在高倍鏡下(200×)計(jì)數(shù)3個(gè)視野的淋巴管數(shù)量，然后取均值即為L(zhǎng)VD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌淋巴管的形態(tài)特征及分布

鼻咽癌組織D2-40免疫組化染色陽(yáng)性的淋巴管管腔形狀和大小不規(guī)則。輕度鼻咽黏膜炎組織D2-40標(biāo)記的淋巴管散在分布，其淋巴管管腔形狀及大小規(guī)則。鼻咽癌組織LVD高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)(表1)。

表1 鼻咽癌組織與對(duì)照組LVD的比較

鼻咽癌組織中D2-40免疫組化染色陽(yáng)性的淋巴管主要分布于腫瘤組織周圍，尤其是癌組織與正常組織的交界處。瘤周淋巴管管腔呈擴(kuò)張狀態(tài)。瘤內(nèi)淋巴管分布較少或缺如，多呈塌陷或閉塞狀態(tài)。66例鼻咽癌組織中瘤周LVD明顯高于瘤內(nèi)LVD，差異有顯著性意義(P<0.01)(表2)。

表2 鼻咽癌組織中瘤周LVD與瘤內(nèi)LVD的比較

2.2 LVD與鼻咽癌組織臨床病理特征的關(guān)系

鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者瘤周LVD大于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及T分期的瘤周LVD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；年齡<49歲的鼻咽癌患者與年齡≥49歲的患者瘤內(nèi)LVD比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同性別、T分期、N分期、M分期及臨床分期的瘤內(nèi)LVD比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.3 LVD與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

鼻咽癌瘤周LVD與其N分期有關(guān)，N分期越高，瘤周LVD越大(P<0.05)，瘤內(nèi)LVD與N分期無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)(表4)。

3 討論

近年研究證實(shí)腫瘤組織中存在淋巴管的新生，淋巴管密度是評(píng)估腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)[6]。有學(xué)者報(bào)道胰腺癌、上尿路移行細(xì)胞癌組織存在淋巴管生成，并認(rèn)為瘤周淋巴管為功能性淋巴管，瘤內(nèi)淋巴管為非功能性淋巴管[3-4]。腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)某些促淋巴管生成因子，如VEGF-C誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管的生成，從而對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[7]。而且，Shi等[8]通過(guò)對(duì)大鼠胰腺癌原位移植模型靜脈注射或瘤內(nèi)注射ShRNA靶向阻斷VEGF-C結(jié)合通路，并應(yīng)用RT-qPCR和ELISA檢測(cè)腫瘤組織對(duì)VEGF-C的表達(dá)，而且借助D2-40、CD31免疫組化標(biāo)記腫瘤組織中的淋巴管和血管，發(fā)現(xiàn)VEGF-C ShRNA可明顯移植腫瘤生長(zhǎng)和下調(diào)VEGF-C mRNA表達(dá)，造成腫瘤組織微淋巴管密度減少。

表3 鼻咽癌淋巴管密度與其臨床病理特征的關(guān)系

表4 瘤周LVD及瘤內(nèi)LVD與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示NPC組織LVD顯著高于輕度鼻咽黏膜炎的鼻咽組織，這說(shuō)明鼻咽癌組織存在淋巴管的新生。本組鼻咽癌瘤周LVD明顯高于瘤內(nèi)，迄今認(rèn)為其機(jī)制是腫瘤組織分泌大量的促淋巴管新生分子。而且，瘤周淋巴管呈開(kāi)放狀態(tài)，而瘤內(nèi)淋巴管常呈閉塞或塌陷狀態(tài)，這與馮正虎等[9]的研究結(jié)果一致。推測(cè)腫瘤組織周圍區(qū)域的淋巴管為功能性淋巴管，這有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究尚觀察到存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌瘤周LVD明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，尤其是瘤周LVD與鼻咽癌患者N分期升高呈一致性，此可能有助于為鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供病理生理學(xué)基礎(chǔ)，其主要機(jī)制是瘤周LVD的增加使腫瘤細(xì)胞與淋巴管接觸面積增大，導(dǎo)致瘤細(xì)胞更易于進(jìn)入淋巴管和向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。近來(lái)，Bolenz等[10]應(yīng)用D2-40和CD34雙重免疫組化染色65例上尿路移行細(xì)胞癌組織，結(jié)果顯示瘤周LVD分別高于瘤內(nèi)LVD及周圍正常組織的LVD，該學(xué)者認(rèn)為瘤周淋巴管在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中為功能性淋巴管，而瘤周LVD可作為判斷上尿路移行細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)之一。同時(shí)，學(xué)者們觀察到存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌、輸尿管癌組織LVD顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，LVD與臨床病理特征如腫瘤大小、類型、分級(jí)及淋巴管侵犯無(wú)明顯關(guān)系[11-12]。

然而，也有一些結(jié)果與上述不一致。例如，Ozardili等[13]觀察到瘤內(nèi)LVD與腎癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但是與該腫瘤的分級(jí)、分期及淋巴管的侵犯無(wú)明顯關(guān)系。另有報(bào)道宮頸鱗癌、直腸癌中的淋巴管與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[14-15]，這可能與腫瘤的發(fā)生部位、組織學(xué)類型及微環(huán)境產(chǎn)生的淋巴管生成因子有關(guān)。

本研究提示鼻咽癌組織存在淋巴管新生，尤其是瘤周淋巴管在腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展過(guò)程起到重要作用。然而淋巴管新生對(duì)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的確切病理機(jī)制有待研究。腫瘤組織淋巴管新生的研究有益于開(kāi)拓腫瘤治療的新策略，如針對(duì)腫瘤淋巴管新生的靶向治療的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

[1] Luo DH，Zhou CW，Li EN，et al.Post-radiation CT changes and recurrent nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Chin Med J，2008，121(10)：916-922.

[2] Bensouda Y，Kaikani W，Ahbeddou N，et al.Treatme-nt for metastatic nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis，2011，128(2)：79-85.

[3] Cheng P，Jin G，Hu X，et al.Analysis of tumor-induced lym-phangiogenesis and lymphatic vessel invasion of pancreatic carcinoma in the peripheral nerve plexus〔J〕.Cancer Sci，2012，103(10)：1756-1763.

[4] Bolenz C，F(xiàn)ernández MI，Trojan L，et al.Lymphangiogenesis occurs in upper tract urothelial carcinoma and correlates with lymphatic tumour dissemination and poor prognosis〔J〕.BJU Int，2009，103(8)：1040-1046.

[5] Zhang SQ，Yu H，Zhang LL.Clinical implications of incre-ased lymph vessel density in the lymphatic metastasis of early stage invasive cervical carcinoma： a clinical immunohistochemical method study〔J〕.BMC Cancer，2009，9(10)：64.

[6] Wang Z，Wu J，Li G，et al.Lymphangiogenesis and biological behavior in pancreatic carcinoma and other pancreatic tumors〔J〕.Mol Med Rep，2012，5(4)： 959-963.

[7] Chen SX，Li XY，Kong XL，et al.The expression of vascular endothelial growth factor-C in oral squamous cell carcinoma and its associations with angiogenesis，lymphangiogenesis and lymph node metastasis〔J〕.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2010，28(3)：319-323.

[8] Shi Y，Tong M，Wu Y，et al.VEGF-C ShRNA Inhibits Pancr-eatic Cancer Growth and Lymphangiogenesis in an Orthotopic Fluorescent Nude Mouse Model〔J〕.Anticancer Res，2013，33(2)：409-417.

[9] 馮正虎，李春青，楊 蘭，等.口腔鱗癌中D2-40表達(dá)的特點(diǎn)及臨床意義〔J〕.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2009，12(18)：701-704.

[10] Bolenz C，F(xiàn)ernández MI，Trojan L，et al.Lymphangiogenesis occurs in upper tract urothelial carcinoma and correlates with lymphatic tumour dissemination and poor prognosis〔J〕.BJU Int，2009，103(8)：1040-1046.

[11] De Sousa SF，Gleber-Netto FO，de Oliveira-Neto HH，et al.Lymphangiogenesis and podoplanin expression in oral squamous cell carcinoma and the associated lymph nodes〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2012，20(6)：588-594.

[12] Lee SK，Cho EY，Kim WW，et al.The prediction of lymp-h node metastasis in ductal carcinoma in situ with microinvasion by assessing lymphangiogenesis〔J〕.J Surg Oncol，2010，102(3)：225-229.

[13] Ozardili I，Guldur ME，Ciftci H，et al.Correlation between l-ymphangiogenesis and clinicopathological parameters in renal cell carcinoma〔J〕.Singapore Med J，2012，53(5)： 332-335.

[14] Xiong Y，Cao LP，Rao HL，et al.Clinical significance of peritumoral lymphatic vessel density and lymphatic vessel invasion detected by D2-40 immunostaining in FIGO Ib1-IIa squamous cell cervical cancer〔J〕.Cell Tissue Res，2012，348(3)： 515-522.

[15] Cacchi C，Arnholdt HM，Jahnig H，et al.Clinical significance of lymph vessel density in T3 colorectal carcinoma〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012，27(6)：721-726.