結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變中LGR5的表達(dá)及其意義

肖幼華 李 榮 蔡聯(lián)明 謝旭平 盧致洋 陳漢民 王冬梅 雷先華

結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變是結(jié)直腸癌的癌前病變，是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個病理階段，是一個新的病理診斷名詞，各級醫(yī)院均已普遍使用這一診斷名詞，其病變限于黏膜上皮或只侵犯固有膜而沒有通過黏膜肌層到黏膜下層，無轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。治療方法主要是局部手術(shù)治療。有文獻(xiàn)報(bào)道，術(shù)前50%～90%的結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后被證實(shí)為結(jié)直腸癌，而結(jié)直腸癌，則需要采用根治性手術(shù)。本研究通過檢測結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤，腺瘤及腺癌LGR5蛋白表達(dá)水平可將上皮內(nèi)瘤變與腺癌區(qū)別開來，從而選擇正確的外科治療方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集贛州市腫瘤醫(yī)院2011年-2012年住院及門診病例，其中結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變60例(腺瘤合并高級別上皮內(nèi)瘤變32例，腺瘤合并低級別上皮內(nèi)瘤變28例)其中有3例合并腺癌，男性46例，女性24例，年齡29～79歲，隨機(jī)選取腺瘤10例，男性6例，女性4例，年齡37～69歲，均取自電切或手術(shù)切除標(biāo)本。高分化腺癌20例，男性11例，女性9例，年齡30～70歲，均取自同期手術(shù)切除標(biāo)本。各組臨床病理資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無差異。

1.2 主要試劑

兔腸上皮干細(xì)胞蛋白單克隆抗體Anti- LGR5及SP-0023免疫試劑盒，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

厚4 μm 的石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精再水化。置CBS(pH6.0)高壓熱修復(fù)20 min，自然冷卻，PBS沖洗3 次，每次3 min。加LGR5 一抗，37 ℃溫箱孵育1 h。PBS 沖洗3 次，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS 沖洗3 次。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片，在顯微鏡下觀察攝片。用PBS 代替一抗作為陰性對照，用經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證的已知陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷

LGR5以胞質(zhì)呈棕黃色為陽性染色。高倍鏡下(× 200)每張切片隨機(jī)選擇5 個視野，每個視野計(jì)數(shù)200 個腫瘤細(xì)胞，共1 000 個，計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。腫瘤細(xì)胞無著色為(-)； 陽性細(xì)胞數(shù)< 25% 為(+)； 25%～50%為(++)；> 50%為(+++)。所有切片均由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法做出判斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。免疫組化檢測數(shù)據(jù)行Fisher精確檢驗(yàn)，Pearson Chi-square檢驗(yàn)。以P<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織中LGR5表達(dá)情況

LGR5 免疫組化陽性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色細(xì)顆粒狀，細(xì)胞核和細(xì)胞膜幾乎不著色。結(jié)直腸腺瘤中LGR5陽性表達(dá)率為40.00%(4/10)，上皮內(nèi)瘤變中其陽性表達(dá)率為83.33%(50/60)，腺癌為100.00%(20/20)，見表1。

表1 結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變、腺瘤、腺癌中LGR5表達(dá)情況/例

2.2 LGR5表達(dá)與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級的關(guān)系

LGR5在高級別上皮內(nèi)瘤變組和低級別上皮內(nèi)瘤變組中陽性表達(dá)率分別為84.37%(27/32)、82.14%(23/28)，結(jié)果表明LGR5表達(dá)水平與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級無相關(guān)性(表2)。

表2 LGR5表達(dá)與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級的關(guān)系/例

3 討論

LGR5(rich in leucine repeated units of G protein coupled receptor 5)屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，可在胃腸道、毛囊等多種組織表達(dá)。新近研究表明LGR5是Wnt通路的目標(biāo)基因，與R-脊蛋白結(jié)合能夠增強(qiáng)Wnt/B-catenin信號，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)LGR5表達(dá)陽性的干細(xì)胞是結(jié)直腸癌的起始細(xì)胞，作為潛在的結(jié)直腸干細(xì)胞標(biāo)志物的LGR5在結(jié)直腸癌中大量表達(dá)[1-2]。結(jié)直腸癌發(fā)生的病理過程，是從腺瘤—上皮內(nèi)瘤變—腺癌的過程，結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變作為結(jié)直腸癌的癌前病變，是腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔┑囊粋€重要環(huán)節(jié)。檢測LGR5在結(jié)直腸癌不同病理階段的表達(dá)，有助于結(jié)直腸癌的早期診斷[3]。

有資料表明LGR5可促進(jìn)結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生，從而促進(jìn)腺瘤向上皮內(nèi)瘤變，腺癌的轉(zhuǎn)變[4-5]。Becker等[6]運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法比較正常結(jié)腸、癌前病變以及結(jié)腸腺瘤LGR5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常的組織中LGR5在隱窩基底部表達(dá)，而在癌前病變的組織中LGR5的表達(dá)并不局限于隱窩基底部且表達(dá)量較高，結(jié)腸腺瘤中LGR5較少在基底部表達(dá)，而是在腺腔的表面大量表達(dá).此研究表明LGR5是人腸道干細(xì)胞的一個潛在標(biāo)志物，其失巢表達(dá)是干細(xì)胞向癌前病變轉(zhuǎn)變的早期事件，并在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。本研究中，在腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌當(dāng)中均能檢出LGR5，說明腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌的發(fā)生均來源于結(jié)直腸干細(xì)胞。

本研究還發(fā)現(xiàn)LGR5在腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌中的表達(dá)水平不一致。腺瘤表現(xiàn)為陰性和陽性，在上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)陽性和中陽性，在腺癌中表現(xiàn)為中陽性和強(qiáng)陽性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中有3例上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本取自距腺癌4～10 cm，均表現(xiàn)為中陽性，且腺癌組織表現(xiàn)為中陽性，兩者完全吻合，說明這3例標(biāo)本也已癌變。

有資料表明，術(shù)前50%～90%的結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后被證實(shí)為結(jié)直腸癌[7]。利用LGR5在腺瘤，上

皮內(nèi)瘤變，腺癌中的表達(dá)水平不一致這一特點(diǎn)，我們可以用于上皮內(nèi)瘤變的鑒別診斷，是上皮內(nèi)瘤變，還時腺癌，為外科醫(yī)生選擇手術(shù)方式提供依據(jù)。本研究中10例LGR5表達(dá)陰性及30例表達(dá)陽性者，均為上皮內(nèi)瘤，手術(shù)采取電切術(shù)，局部切除術(shù)。18例表達(dá)中陽性者，有9例是腺癌，50%的中陽性患者需行根治性手術(shù)，還有50%的中陽性患者則需腸段切除術(shù)。許多研究表明LGR5在癌組織及癌旁組織大量表達(dá)[1]，對于結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變中LGR5表達(dá)中陽性者，就給予腸段切除或根治性手術(shù)。高級別上皮內(nèi)瘤變中，1例表達(dá)為強(qiáng)陽性者，經(jīng)局部切除后，術(shù)后病理診斷為腺癌，而行二次手術(shù)。低級別上皮內(nèi)瘤變中，1例表達(dá)強(qiáng)陽性者，術(shù)前為腺瘤，行局部切除，術(shù)后為低級別上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后8個月，轉(zhuǎn)變?yōu)橹蹦c癌，而行Miles手術(shù)。

綜上所述，對于術(shù)前病理診斷為結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，加做LGR5檢測，根據(jù)LGR5表達(dá)水平不同，可以鑒別是瘤變，還是腺癌，LGR5是鑒別結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤的良好的免疫組化指標(biāo)，為選外科手術(shù)方式提供重要的參考依據(jù)，避免了行二次腸鏡，二次病理活檢，二次手術(shù)。

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